利用RNAi技術(shù)鑒定SRBSDV在白背飛虱體內(nèi)增殖的關(guān)鍵因子.pdf

1、南方水稻黑條矮縮病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV）是呼腸孤病毒科（Reoviridae）斐濟(jì)病毒屬（Fijivirus）的一個(gè)暫定種，由介體昆蟲白背飛虱（Sogatella furcifera）以持久增殖型方式傳播，但不經(jīng)卵傳播。由SRBSDV引發(fā)的南方水稻黑條矮縮病在我國(guó)南方稻區(qū)以及越南稻區(qū)等地暴發(fā)流行給水稻生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的損失。病毒編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)于病毒在介體昆蟲

2、體內(nèi)的運(yùn)動(dòng)、復(fù)制和裝配等起著重要作用。SRBSDV編碼的P5-1、P6和P9-1蛋白是病毒原質(zhì)的組分，參與病毒的復(fù)制和裝配。但是同為病毒原質(zhì)的組分，P5-1、P6和P9-1各自在病毒原質(zhì)和病毒復(fù)制中起著什么作用還沒(méi)有明確。RNAi技術(shù)是近年來(lái)研究基因功能的一個(gè)重要技術(shù)手段，利用RNAi技術(shù)進(jìn)行植物病毒病的防治已成為重要的手段。因此，本研究擬利用RNAi技術(shù)鑒定SRBSDV在白背飛虱體內(nèi)復(fù)制起始的關(guān)鍵基因，為病毒病的防控提供一個(gè)高效靶標(biāo)基

3、因。
　　本實(shí)驗(yàn)首先擴(kuò)增SRBSDV-P5-1 N-端1-750 bp基因片段，通過(guò)Gateway體系構(gòu)建原核表達(dá)載體，特異性誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白條帶后注射新西蘭大白兔制備多克隆抗體，Western blot和免疫熒光標(biāo)記技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)所制備的多克隆抗體能特異性檢測(cè)SRBSDV侵染水稻和白背飛虱表達(dá)的P5-1蛋白，表明本實(shí)驗(yàn)所制備P5-1多克隆抗體具有較好的特異性。以SRBSDV病毒原質(zhì)組分P5-1、P6和P9-1蛋白為研

4、究對(duì)象，利用T7轉(zhuǎn)錄酶體外合成其雙鏈RNA（double-stand RNA, dsRNA），利用顯微注射法將濃度約為0.5μg/μL的dsRNA導(dǎo)入飼毒2 d的白背飛虱體內(nèi)，同時(shí)以注射dsGFP的處理為對(duì)照。注射后6 d用相關(guān)蛋白的熒光抗體進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記，共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，分別干擾P5-1、P6和P9-1基因表達(dá)后，均能明顯抑制相關(guān)基因P5-1、P6、P9-1、P7-1和P10在白背飛虱體內(nèi)的表達(dá)，且病毒被限制在初侵染的中腸上皮

5、細(xì)胞中，沒(méi)有發(fā)生擴(kuò)散。抑制P5-1蛋白表達(dá)后，P6和P9-1蛋白仍可表達(dá)，但僅限于在初侵染細(xì)胞中表達(dá)，P7-1和P10蛋白表達(dá)受到明顯抑制，認(rèn)為 P5-1作為與病毒粒體裝配有關(guān)的蛋白，其調(diào)控著外殼蛋白和擴(kuò)散相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而阻礙了病毒在白背飛虱體內(nèi)的裝配和擴(kuò)散。干擾P6蛋白的表達(dá)后，84％的昆蟲體內(nèi)檢測(cè)不到P6蛋白，同時(shí)也檢測(cè)不到P5-1、P9-1、P7-1和P10蛋白，但在16%的昆蟲上皮細(xì)胞內(nèi)可檢測(cè)到P6蛋白，此時(shí)也可檢測(cè)到P5-

6、1、P9-1、P7-1和P10蛋白，表明P6蛋白不表達(dá)則不能啟動(dòng)病毒的增殖，一旦P6蛋白有少量的表達(dá)則啟動(dòng)病毒在上皮細(xì)胞內(nèi)的增殖。抑制P9-1蛋白的表達(dá)后，P6蛋白仍可表達(dá)，但也僅局限在初侵染的上皮細(xì)胞內(nèi)，而P5-1蛋白的表達(dá)受到抑制，同時(shí)P7-1和P10蛋白的表達(dá)也受到明顯抑制，表明參與病毒基因組復(fù)制的P9-1蛋白表達(dá)受抑制后，參與病毒裝配的P5-1蛋白和外殼蛋白P10的表達(dá)受到抑制，同時(shí)由于病毒無(wú)法裝配，使管狀結(jié)構(gòu)蛋白P7-1表達(dá)受

7、到抑制。此外，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)了dsRNA對(duì)病毒增殖的影響，發(fā)現(xiàn)干擾P5-1、P6和P9-1基因的表達(dá)后，編碼病毒外殼蛋白的P10基因拷貝數(shù)相對(duì)處理組明顯下降，表明病毒在白背飛虱體內(nèi)的復(fù)制和增殖受到阻礙。Western blot檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)分別抑制P5-1、P6和P9-1蛋白的表達(dá)后，能明顯抑制其它相關(guān)蛋白的表達(dá)。其中抑制P5-1蛋白表達(dá)后，能檢測(cè)P6和P9-1蛋白能有少量表達(dá)，P10幾乎沒(méi)有表達(dá)，干擾P6表達(dá)后，均沒(méi)有檢測(cè)到

8、相關(guān)蛋白的表達(dá)；抑制P9-1蛋白表達(dá)后，P6蛋白有少量表達(dá)，其余相關(guān)蛋白均沒(méi)有檢測(cè)到。
　　綜上所述，本研究通過(guò)dsRNA誘導(dǎo)的RNAi技術(shù)，明確了P5-1、P6和P9-1均是 SRBSDV在昆蟲體內(nèi)增殖的重要蛋白，抑制單個(gè)基因的表達(dá)均能明顯抑制病毒在介體昆蟲體內(nèi)的復(fù)制和擴(kuò)散。P6蛋白在病毒增殖中起最關(guān)鍵的作用，負(fù)責(zé)啟動(dòng)病毒在初侵染上皮細(xì)胞內(nèi)的增殖，抑制P6蛋白的表達(dá)則抑制病毒所有蛋白的表達(dá)；P9-1蛋白作為病毒基因組復(fù)制的場(chǎng)所，