利用PolⅡ-ChIP技術(shù)鑒定肝病關(guān)聯(lián)基因ESR1-CXCL10rSNP的初步研究.pdf

1、慢性乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)感染是世界范圍內(nèi)主要的感染病之一，HBV的持續(xù)感染與病毒、環(huán)境和宿主的遺傳感染易感性等密切相關(guān)，研究慢性HBV感染及其相關(guān)肝病的遺傳易感性具有十分重要的意義。單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)構(gòu)成人類基因組90％以上的變異，被廣泛用于連鎖分析與疾病易感性等研究。我科前期病例對照分析和疾病關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)雌激素受體α(ESR1)和CXCL

2、10基因與慢性HBV感染及其疾病進(jìn)程相關(guān)。兩個(gè)基因中，關(guān)聯(lián)的標(biāo)記SNP位點(diǎn)均位于非編碼區(qū)，關(guān)聯(lián)區(qū)域均無高頻編碼區(qū)SNP(cSNP)位點(diǎn)。通過功能實(shí)驗(yàn)鑒定與疾病直接相關(guān)的ESR1和CXCL10基因調(diào)節(jié)性SNP(regulatorySNP,rSNP)是十分必要的，目前尚未見這方面研究的文獻(xiàn)報(bào)道。 由于SNP為雙等位多態(tài)，兩種等位多態(tài)之間僅有1個(gè)堿基的差異，其功能研究必須在表達(dá)水平或蛋白水平揭示單堿基等位特異性的差異。對于非編碼區(qū)(啟

3、動(dòng)子或內(nèi)含子區(qū)域)的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，SNP的等位特異性差異無法在mRNA轉(zhuǎn)錄本得到反映，通常以該SNP位點(diǎn)附近序列為對象，通過報(bào)告基因試驗(yàn)研究不同等位對該序列啟動(dòng)子活性的影響，或通過電泳移動(dòng)漂移實(shí)驗(yàn)(EMSA)分析不同等位的寡核苷酸探針結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子能力的差異。我們鑒定出的疾病關(guān)聯(lián)SNP位點(diǎn)位于基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，緊密連鎖不平衡的區(qū)域內(nèi)存在眾多的SNP，要找出其中與疾病直接相關(guān)的rSNP，用上述兩種方法存在困難，迫切需要發(fā)展快速、高通量、多位點(diǎn)協(xié)同

4、的rSNP功能研究方法。 本研究試圖利用近幾年來發(fā)展的一種DNA-蛋白相互作用研究技術(shù)—染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(chromatinimmunoprecipitation，ChIP)為基礎(chǔ)而建立的一種高通量的技術(shù)—PolⅡ-ChIP技術(shù)，通過測定等位特異性的RNA多聚酶來反映雙等位的SNP等位表達(dá)量的差異，從而鑒定出影響肝病的rSNP位點(diǎn)。 采用常規(guī)方法培養(yǎng)多種細(xì)胞；其中對HepG2細(xì)胞株基因組DNA和cDNA中的SNRPN基

5、因用RT-PCR為基礎(chǔ)的RFLP方法進(jìn)行基因分型，檢測出SNRPN(小核核糖核蛋白多肽N)基因在肝癌腫瘤HepG2細(xì)胞株中的表達(dá)狀況；通過對ChIP技術(shù)中固定、超聲、免疫沉淀、洗滌等關(guān)鍵步驟的摸索，優(yōu)化出重復(fù)性好、穩(wěn)定性高的PolⅡ-ChIP技術(shù)方案；利用PolⅡCTD末端Ser5特異性抗體進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀，針對SNP位點(diǎn)兩側(cè)序列設(shè)計(jì)PCR引物和延伸引物，以外側(cè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用延伸引物進(jìn)行VSET引物延伸，產(chǎn)物純化后經(jīng)MALD

6、I-TOF質(zhì)譜鑒定。對對數(shù)生長期的HepG2肝癌細(xì)胞株和L02細(xì)胞株分別用β-雌二醇刺激后進(jìn)行PolⅡ-ChIP，針對文獻(xiàn)報(bào)道的8個(gè)可能啟動(dòng)子區(qū)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增、測序，鑒定ESR1基因啟動(dòng)子的使用情況并試圖發(fā)掘可能存在的調(diào)節(jié)性SNP。采用PolⅡ-ChIP和MGB-熒光定量PCR檢測CXCL10G49392A位點(diǎn)的等位特異性調(diào)控活性。 我們的主要研究結(jié)果如下： 1.HepG2細(xì)胞SNRPN外顯子4nt1654312位點(diǎn)(

7、數(shù)字依據(jù)NT026446，SNPrs705)為雜合子(C/T)；RT-PCR為基礎(chǔ)的RFLP分析表明，SNRPN的雙等位基因中只有一個(gè)等位基因的產(chǎn)生mRNA轉(zhuǎn)錄本，其基因印跡狀態(tài)未丟失。 2.通過對ChIP技術(shù)中固定、超聲、免疫沉淀、洗滌等關(guān)鍵步驟的摸索，優(yōu)化出比較成熟的ChIP技術(shù)方案。 3.以印跡基因SNRPN為研究對象，對雜合子細(xì)胞的SNRPNC1654312TSNP進(jìn)行PolⅡ-ChIP-PE-MS分析發(fā)現(xiàn)，基因

8、組DNA樣本和染色質(zhì)免疫沉淀前樣本在C、T等位點(diǎn)都包含相同PolⅡ結(jié)合量，但免疫沉淀后標(biāo)本(被磷酸化RNA多聚酶Ⅱ結(jié)合的染色質(zhì))就僅在T等位點(diǎn)有結(jié)合，與產(chǎn)生mRNA轉(zhuǎn)錄的等位點(diǎn)相對應(yīng)。采用PolⅡ-ChIP技術(shù)鑒定疾病關(guān)聯(lián)rSNP是可行的，具有重復(fù)性好，穩(wěn)定性高的優(yōu)點(diǎn)。 4.β-雌二醇刺激不同肝細(xì)胞后進(jìn)行PolⅡ-ChIP發(fā)現(xiàn)，HepG2肝癌細(xì)胞株中ESR1啟動(dòng)子E1、E2、F沉淀出有PolⅡ的結(jié)合的片段，而在L02細(xì)胞株中則僅

9、啟動(dòng)子D有PolⅡ的結(jié)合的片段沉淀出來。 5.針對ESR1基因啟動(dòng)子區(qū)域的測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，ESR1基因啟動(dòng)子區(qū)D區(qū)198104位點(diǎn)存在SNP(T/A)以及198461位點(diǎn)存在SNP(G/T)。 6.采用PolⅡ-ChIP和MGB-TaqMan探針熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)CXCL105'側(cè)翼G49392A位點(diǎn)的存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的等位特異性差異，G等位高于A等位。 總之，我們優(yōu)化出比較成熟的ChIP技術(shù)方案，驗(yàn)證了P

10、olⅡ-ChIP技術(shù)通過檢測雜PolⅡ結(jié)合量來反映SNP雙等位表達(dá)量的差異的可靠性，可以利用PolⅡ-ChIP策略鑒定疾病關(guān)聯(lián)基因SNPs的功能，為后續(xù)研究優(yōu)化出可靠的技術(shù)平臺(tái)。利用PolⅡ-ChIP技術(shù)鑒定并證明了ESR1的表達(dá)在不同肝細(xì)胞中受不同的啟動(dòng)子的調(diào)控。HepG2肝癌細(xì)胞株中ESR1的表達(dá)受啟動(dòng)子E1、E2、F調(diào)控，而在L02細(xì)胞株中ESR1的表達(dá)受啟動(dòng)子D調(diào)控，初步發(fā)掘出兩個(gè)位于啟動(dòng)子區(qū)可能是潛在的rSNP的位點(diǎn)。初步證實(shí)