髓初始髓源抑制細(xì)胞亞群表型鑒定及對(duì)t細(xì)胞免疫抑制功能的研究-免疫學(xué)

1、<p><b>　　主要英文縮略語(yǔ)索引</b></p><p><b>　　中文摘要</b></p><p>　　目的： MDSCs是一群異質(zhì)性的細(xì)胞，通常在腫瘤，感染，炎癥和移植等病理情況時(shí)增多。一般認(rèn)為，在病理狀態(tài)下，MDSCs對(duì)免疫系統(tǒng)具有廣泛的抑制作用，發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能；而正常狀態(tài)下，MDSCs是否具有免疫抑制作用尚有爭(zhēng)論

2、。目前，多數(shù)研究針對(duì)腫瘤和感染等病理?xiàng)l件下混合MDSCs或MDSCs的亞群進(jìn)行研究，而對(duì)骨髓初始MDSCs的研究相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)旨在使用Gfi1:GFP基因敲入小鼠模型，從正常模型小鼠的骨髓中分離初始MDSCs （naïve MDSCs），運(yùn)用流式細(xì)胞儀（BD FACS Aria）分選不同亞群細(xì)胞，采用免疫學(xué)方法，研究初始MDSCs及其亞群在正常情況下可能具有的表型和T細(xì)胞免疫抑制功能；重點(diǎn)研究骨髓naïve MDS

3、Cs不同亞群對(duì)T細(xì)胞功能的影響及其機(jī)制。</p><p>　　方法：通過(guò)對(duì)Gfi1：GFP基因敲入C57BL/6J小鼠模型骨髓細(xì)胞分離純化，利用免疫磁珠技術(shù)分離骨髓初始MDSCs(CD11b+細(xì)胞)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分選純度；利用離心涂片法和Wright Giemsa染色法對(duì)初始MDSCs進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析；將骨髓初始MDSCs分別與CD3/28 Dynabeads T-Activator預(yù)刺激的CD4+T或CD8+T

4、細(xì)胞共培養(yǎng)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)它們對(duì)CD4+T和CD8+T細(xì)胞增殖功能的影響。利用流式細(xì)胞技術(shù)根據(jù)CD11b 、Gr1和Gfi1:GFP表達(dá)的差異將MDSCs 分為不同亞群，并鑒定其表型CD62L、Ly6C、CD204、CD206、CD80、CD86、TLR4、TLR2、CD124、CD210等的表達(dá)差異；用離心涂片法和Wright Giemsa染色法對(duì)不同亞群進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析；用純化的骨髓初始MDSCs的不同亞群細(xì)胞分別與CD3/28 Dy

5、nabeads T-Activator預(yù)刺激的CD4+T或CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)它們對(duì)CD4+T和CD8+T細(xì)胞增殖功能的影響；并應(yīng)用Realtime-PCR方法檢測(cè)不同亞群細(xì)胞抗炎因子及相關(guān)</p><p>　　結(jié)果： 骨髓初始MDSCs是健康小鼠免疫細(xì)胞的重要組成成分，其形態(tài)為大小不一、胞質(zhì)呈淡藍(lán)色、核為分葉形、環(huán)形或橢圓形的細(xì)胞群；初始MDSCs在體外可以抑制CD4+T和CD8+T細(xì)胞增殖，在

6、體內(nèi)可以延緩和降低小鼠急性肝衰竭模型的死亡率。按CD11b 、Gr1和Gfi1:GFP等分子表達(dá)的差異及細(xì)胞形態(tài)學(xué)差異可將初始MDSCs分為四個(gè)亞群：CD11b+Gr1+ GFP-（M1）、CD11blowGr1low GFP+（G1）、CD11blowGr1high GFP+（G2）及CD11bhighGr1high GFP+（G3）。在正常小鼠骨髓細(xì)胞中，G1群細(xì)胞占骨髓總細(xì)胞的1.19±0.38%，占骨髓初始MDSCs的

7、4.04±0.9%；G2群細(xì)胞占骨髓總細(xì)胞的8.49±2.69%，占骨髓MDSCs的28.9±5.25%；G3群細(xì)胞占骨髓總細(xì)胞的6.04±1.55%，占骨髓MDSCs的20.95±4.98%；M1群細(xì)胞占骨髓總細(xì)胞的3.86±1.06%，占骨髓MDSCs的13.25±2.65%。G1群細(xì)胞體積較大主要是以環(huán)形核幼稚的粒細(xì)胞為主，G2群細(xì)胞以環(huán)形核和分葉核的幼稚粒細(xì)胞

8、為主，G3群</p><p><b>　　結(jié)論： </b></p><p>　　正常小鼠骨髓初始MDSCs（CD11b+細(xì)胞）能分別抑制CD4+T或CD8+T細(xì)胞增殖，并且能延緩和降低小鼠急性肝衰竭模型的死亡率。</p><p>　　根據(jù)初始MDSCs的CD11b 、Gr1和Gfi1:GFP表達(dá)差異及細(xì)胞形態(tài)學(xué)差異可將其可分為M1、G1、G2及

9、G3四個(gè)亞群：?jiǎn)魏讼祦喨杭?xì)胞M1（CD11b+Gr1+ GFP-）和粒系亞群細(xì)胞G1（CD11blowGr1low GFP+）、G2 （CD11blowGr1high GFP+）及G3（CD11bhighGr1high GFP+）。</p><p>　　在骨髓初始MDSCs四個(gè)亞群中，G2和G3均能不同程度的抑制CD4+T和CD8+T細(xì)胞增殖，而G1和M1對(duì)CD4+T和CD8+T細(xì)胞的增殖無(wú)明顯抑制作用；G2亞群

10、細(xì)胞可能通過(guò)分泌抗炎因子IL-4、IL-10發(fā)揮免疫抑制作用，G3亞群細(xì)胞可能通過(guò)分泌抗炎因子IL-10和炎性因子IFN-γ發(fā)揮免疫抑制作用。</p><p>　　骨髓初始MDSCs的G2和G3亞群細(xì)胞對(duì)CD4+T和CD8+T細(xì)胞增殖抑制作用的機(jī)制可能與NOS2和ArgI 兩種酶無(wú)關(guān)。</p><p>　　關(guān)鍵詞：初始髓源抑制細(xì)胞；細(xì)胞亞群；免疫抑制；T淋巴細(xì)胞</p>&l

11、t;p>　　Identification of Bone Marrow Naive Myeloid-Derived Suppressor Cells Subpopulations with Distinct Phenotype and T Cell Suppressive Activity</p><p><b>　　ABSTRACT</b></p><p>　

12、　Objectives：</p><p>　　MDSCs are a group of heterogeneous cells, usually increased in tumor, infection, and inflammation and transplantation disease. It has a broad inhibitory function to immune system in pat

13、hological conditions and plays a regulator of the immune system; it is a debate about the inhibitory function of naïve MDSCs in normal condittions. Currently, mixed-MDSCs or different subsets of MDSCs have been rese

14、arched in different pathological conditions such as cancer and infection. This study used the bone m</p><p>　　The bone marrow cells of C57BL/6J Gfi1: GFP knockin mouse model were separated and purificated, n

15、aïve MDSCs of bone marrow were isolated by immunomagnetic beads (CD11b microbeads kit), the purity of naïve MDSCs was detected by FCM; the morphology naïve MDSCs was analyzed of by smear of centrifugation

16、and staining of Wright-Giemsa; Identification naïve MDSCs with CD4+T cells or CD8+T cells pre-stimulated by Dynabeads CD3/28 T-Activator and were cultured to detect CD4+ T and CD8+ T cells function </p><p

17、>　　Naïve MDSCs are important components of normal mice immune system, the morphology of total MDSCs in the bone marrow is large and small, the cytoplasm is blue, and the shape of nucleus is sub-leaf, ring and ova

18、l. CD4+T or CD8+T cells proliferation were inhibited by naïve MDSCs (CD11b+ cells) of normal mice bone marrow, and the mortality of acute hepatic failure (AHF) mice models were delayed and decreased by naïve MD

19、SCs. It could be devided into CD11blowGr1low GFP + (G1), CD11blowGr1highGFP+(G2),</p><p>　　Conclutions：</p><p>　　CD4+T or CD8+T cells proliferation were inhibited by naïve MDSCs (CD11b+ cel

20、ls) of normal mice bone marrow, and the mortality of acute hepatic failure (AHF) mice models were delayed and decreased by naïve MDSCs.</p><p>　　CD11blowGr1lowGFP+(G1),CD11blowGr1highGFP+(G2),CD11bhighG

21、r1highGFP+(G3), CD11b+Gr1lowGFP-(M1) subsets of naïve MDSCs were isolated from bone marrow of Gfi1: GFP knockin normal mice by the difference of Gfi1-GFP , CD11b and Gr1 expression. </p><p>　　In four su

22、bsets of naïve MDSCs, G2 and G3 subsets have different levels of inhibition of CD4 +T or CD8+T cell proliferation respective. However, G1 and M1 subsets of naive MDSCs had no significant inhibition to CD4+T or CD8+T

23、 cells. G2 subset of naïve MDSCs maybe play an immunosuppressive effect by increasing the levels of anti-inflammatory cytokines, such as IL-4 and IL-10. G3 subset of naïve MDSCs maybe play an immunosuppressive

24、effect by increasing the levels of anti-inflammatory cytokines, s</p><p>　　The T cells inhibitory mechanism of G2 and G3 subsets may be not related to NOS2 and ArgI.</p><p>　　Postgraduate： Dongp

25、ing Ren</p><p>　　(Majoring in immunology)</p><p>　　Directed by： Professor Jianhua Xiao</p><p>　　Professor Hui Zeng</p><p>　　Key words:</p><p>　　Naïve

26、Myeloid-derived Suppressor Cells, Cell Subsets, Immune Suppression, T Lymphocytes.</p><p><b>　　引言</b></p><p>　　髓源抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells;MDSCs）是一群異質(zhì)性的細(xì)胞，包括髓系祖細(xì)胞和未成熟髓樣細(xì)胞

27、等，最初發(fā)現(xiàn)于腫瘤患者體內(nèi)，隨后人們也發(fā)現(xiàn)在感染性疾病，炎癥和移植等病理狀態(tài)下累積。目前認(rèn)為，這群細(xì)胞數(shù)量的增多及其免疫抑制功能與細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)感染、腫瘤發(fā)生發(fā)展和移植等病理情況密切相關(guān)[1-3]。生理情況下，具有MDSCs表型的細(xì)胞主要存在于骨髓造血細(xì)胞中，而在脾臟、外周血和淋巴結(jié)中含量較低；該細(xì)胞群的特征類(lèi)似于髓系前體細(xì)胞，可以在體外培養(yǎng)中分化為不同的細(xì)胞集落，如體外培養(yǎng)中添加粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte m

28、acrophage-colony-stimulating factor，GM-CSF）及相關(guān)細(xì)胞因子可以誘導(dǎo)其向粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DCs)分化。而在病理狀態(tài)下，只有部分髓源抑制細(xì)胞可以分化為粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞[4-6]。</p><p>　　普遍認(rèn)為，髓源抑制細(xì)胞具有廣泛的免疫抑制功能，如抑制B細(xì)胞分泌抗體，抑制DC細(xì)胞的成熟和抗原提呈作用，抑制NK細(xì)胞的殺傷

29、作用以及抑制CD4+ T和CD8+ T細(xì)胞增殖和干擾素γ（IFN-γ）分泌[7-9]。有研究表明粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte macrophage-colony-stimulating factor，GM-CSF），血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vsacular endothelial growth factor,VEGF）,白介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）和前列腺素（prostaglandins）可以動(dòng)

30、員并募集骨髓造血祖細(xì)胞[8-13]。一般認(rèn)為，MDSCs可以表達(dá)高水平的誘導(dǎo)性一氧化氮合酶（iNOS or NOS2），這種酶可以分解環(huán)境中所存在的T細(xì)胞活化所必需的精氨酸生成瓜氨酸（citrulline）和一氧化氮（nitric oxide；NO），從而導(dǎo)致CD4+T和CD8+T細(xì)胞活化受阻[14]。此外，MDSCs還可以表達(dá)精氨酸酶I（Arginase-I;ArgI）減少內(nèi)環(huán)境中L-精氨酸的利用率，從而導(dǎo)致CD3ζ表達(dá)缺失，進(jìn)而妨礙

31、</p><p>　　目前研究表明MDSCs可能源自髓系祖細(xì)胞，可在不同的病理狀態(tài)累積，對(duì)T淋巴細(xì)胞具有免疫抑制作用，其抑制作用機(jī)制研究已經(jīng)取得了較多的證據(jù)[16-18]。但是，由于MDSCs是一個(gè)異質(zhì)的細(xì)胞群體，主要由粒系，單核系兩個(gè)不同分化方向的細(xì)胞組成，另外還包括少量的淋巴樣細(xì)胞。通常認(rèn)為，小鼠MDSCs共表達(dá)CD11b和Gr1兩種表面標(biāo)志，在病理狀態(tài)下，對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)具有廣泛的免疫抑制作用，但在正常狀態(tài)下

32、，是否具有免疫抑制作用尚有爭(zhēng)論。為了研究MDSCs的特征和作用機(jī)制，已有報(bào)道將MDSCs分為幾個(gè)具有特征標(biāo)志的亞群：如多形核細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞、單核樣細(xì)胞和粒細(xì)胞樣亞群等[18,19]。由于既往的研究多是針對(duì)混合細(xì)胞進(jìn)行，而小鼠MDSCs均表達(dá)CD11b和Gr1，除此之外無(wú)其他特異的表面標(biāo)志用于粒系和單核系細(xì)胞分群，因此，對(duì)MDSCs理想的分群方法和研究存在爭(zhēng)議。Young等[20]研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)Grl的兩個(gè)不同抗原表位LY6G和LY6C

33、表達(dá)水平的差異，可將荷瘤小鼠脾臟MDSCs分為兩個(gè)不同的細(xì)胞亞群：具有CD11b+LY6G+LY6Clow表型的多形核樣亞群及CD11b+LY6G-LY6Chigh表</p><p>　　為了研究正常小鼠骨髓初始MDSCs是否具有免疫抑制功能及其作用機(jī)制，本課題從正常Gfi1-GFP+/-小鼠骨髓中分離初始MDSCs細(xì)胞，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究其對(duì)T細(xì)胞的免疫抑制作用，通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究其對(duì)機(jī)體廣泛免疫抑制作用；采用流式

34、細(xì)胞儀分選和形態(tài)學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行分群；并對(duì)不同亞群細(xì)胞進(jìn)行了免疫功能和作用機(jī)制研究。旨在探討正常小鼠骨髓初始MDSCs及其亞群的免疫功能差異和作用機(jī)制。</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)材料</b></p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物</b></p><p>　　C57 BL /6J Gfi1:GFP基因敲入小鼠（Gfi1

35、GFP/+），6～8周，雄性，加拿大蒙特利爾大學(xué)Tarik Moroy教授實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送,飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。</p><p>　　野生型C57 BL /6J小鼠，6～8周，雄性，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。許可證編號(hào)：SCXI（京）2009-0007。</p><p><b>　　2．主要實(shí)驗(yàn)試劑</b></p><p>　

36、　2.1抗體、培養(yǎng)基及試劑盒</p><p>　　Percp-Cy 5.5 conjugated Rat Anti-Mouse CD11b antibody (Cat:550993,Lot:22933)、</p><p>　　APC conjugated Rat Anti-Mouse Gr1 antibody (Cat:553129,Lot:32918)、</p><p

37、>　　PE conjugated Rat Anti-Mouse Gr1 antibody (Cat:553128,Lot:09488)、</p><p>　　APC conjugated Rat Anti-Mouse CD62L antibody （Cat:553152;Lot:87443）、</p><p>　　PE conjugated Rat Anti-Mouse CD124

38、antibody（Cat:552509;Lot:90410）、</p><p>　　PE conjugated Rat Anti-Mouse CD210 antibody（Cat:559914;Lot:18318）</p><p>　　以上抗體購(gòu)自美國(guó)BD Bioscience公司；</p><p>　　APC conjugated Rat Anti-Mouse C

39、D80 antibody（Cat:104714;Lot:B124520）、</p><p>　　APC conjugated Rat Anti-Mouse CD86 antibody（Cat:105012;Lot:B107034）：購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司；</p><p>　　PE conjugated Rat Anti-Mouse TLR-2 antibody（Cat:12-90

40、21-80;Lot:E018505）、</p><p>　　PE conjugated Rat Anti-Mouse TLR-4 antibody（Cat:12-9041-80;Lot:E023689）：購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司；</p><p>　　Anti-biotin-APC（Cat:130-090-858）：購(gòu)自德國(guó)Miltenyi Biotec公司；</p>

41、<p>　　CD4+T cell isolation kit ,mouse;（Cat:130-090-860）：購(gòu)自德國(guó)Miltenyi Biotec公司；</p><p>　　CD11b+cell isolation kit,mouse; (Cat:130-049-601)：購(gòu)自德國(guó)Miltenyi Biotec公司；</p><p>　　CD8+T cell isolat

42、ion kit ,mouse;（Cat:130-090-859）：購(gòu)自德國(guó)Miltenyi Biotec公司；</p><p>　　Gibco® RPMI-1640培養(yǎng)基（Cat:11875-093）：購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；</p><p>　　FBS：購(gòu)自美國(guó)PAA公司；</p><p>　　BSA：購(gòu)自美國(guó)KH公司；</p>

43、<p>　　Dynabeads® Mouse T-Activator CD3/28（Cat.No.114.52D）：購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；</p><p>　　BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit (Cat.No.554714) :購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司；</p><p>　　B

44、D FACS®Lysing Solution (Cat.No.349202)：購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司；</p><p>　　RNeasy Plus Mini Kit(Cat.:74134 Lot.:127150466):購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司；</p><p>　　TaqMan®High Capacity RNA-to-cDNA Kit（Cat.N

45、o.4387406） ；</p><p>　　TaqMan®IL-10, molecule probe（Cat:Mm00439615-g1 ,Lot:798831）；</p><p>　　TaqMan®IL-4, molecule probe（Cat: Mm 0045259 ,Lot:791932）；</p><p>　　TaqMan®

46、Arg1, molecule probe（Cat: Mm 00475988 ,Lot:683783）；</p><p>　　TaqMan®NOS2, molecule probe（Cat: Mm 0040483 ,Lot:707143）；</p><p>　　TaqMan®IL-13, molecule probe（Cat: Mm 00434205 ,Lot:80456

47、3）；</p><p>　　TaqMan®IFN-γ, molecule probe（Cat: Mm 99999071 ,Lot:801588）；</p><p>　　TaqMan®TNF-α, molecule probe（Cat: Mm 99999068-m1 ,Lot:808338）；</p><p>　　TaqMan®GAPDH

48、, molecule probe（Cat: Mm 9999915-g1 ,Lot:582795）；</p><p>　　TaqMan®MCP-1, molecule probe（Cat: Mm 99999056-m1 ,Lot:789640）；</p><p>　　TaqMan® Gene Expression Master Mix(Cat: 4369016, Lot:

49、：070815）：均購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司；</p><p>　　HyClone®Penicilin-Streptomycin solution(Cat:SV30010，Lot:：J100131)：購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司；</p><p>　　Nω-Hydroxy-nor-Larginine,Diacetate Salt（nor-

50、NOHA）(Cat.:399275;Lot.No.:D00088455):購(gòu)自德國(guó)EMD Bioscience公司；</p><p>　　Lipopolysaccharides from Escherichia coli 0111:B4（Cat：L2630）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；</p><p>　　NG-Methyl-L-arginine acetate salt,(L-NMMA),N

51、onspecific NOS (Cat:M7033;Lot:029k4051):購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；</p><p>　　7-AAD viability staining solution (Cat:00-6993-50;Lot:E00031-1325).購(gòu)自美國(guó)eBioscience 公司；</p><p>　　Invitrogen Molecular probesTM V12883

52、 component A:5(6)-CFDA,SE.mixed isomers.(Cat:V12883;Lot:25955w) 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；</p><p>　　Lipopolysaccharides from Escherichia coli 0111:B4 cell culture tested（Cat：L4391；Lot:037k7694）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。</p>

53、<p>　　2.2其它試劑和耗材 </p><p>　　磷酸氫二鈉(Cat:2010011），氯化鉀(Cat:20060111），Na2EDTA (Cat:20080111）等試劑均購(gòu)自北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司。</p><p>　　主要試劑及溶液的配制：</p><p>　　1×PBS(0.01mol/L)：</p><

54、;p>　　NaCl8.0 g</p><p><b>　　KCl0.2g</b></p><p>　　Na2HPO4.12H2O3.17g</p><p>　　KH2PO40.2g</p><p>　　去離子水 900ml，</p><p&

55、gt;　　溶解后，定容至1000ml，高壓滅菌，4℃貯存。 </p><p>　　Staining buffer </p><p>　　1×PBS 1000mL</p><p>　　Na2EDTA 7.44g</p><p>　　B

56、SA 5g </p><p>　　以0.22μm濾膜加壓過(guò)濾，4℃貯存。</p><p><b>　　完全培養(yǎng)基</b></p><p>　　RPMI1640培養(yǎng)液 40ml</p><p>　　FBS

57、 10ml</p><p>　　雙抗 1萬(wàn)U/ml</p><p>　　β-巰基乙醇 5µmol/ml </p><p>　　L-Glutamine 2µmol/ml</p><p>　　以5

58、0ml離心管現(xiàn)配現(xiàn)用。</p><p>　　提取RNA所用70％乙醇（以10ml為例）</p><p>　　無(wú)水乙醇 7ml</p><p>　　DEPC水 3ml</p><p>　　RLT buffer（現(xiàn)用現(xiàn)配，以100μl為例）</p><

59、p>　　β-巰基乙醇 1μl </p><p>　　RLT溶液 99μl</p><p>　　充分混勻，此為致癌物質(zhì)，在生物安全柜中配置。</p><p><b>　　3．儀器設(shè)備</b></p><p>　　流式細(xì)胞儀（BD FACS Calibu

60、r） Becton Dickinson and company公司</p><p>　　流式細(xì)胞分選儀（BD FACS Aria） Becton Dickinson and company公司</p><p>　　恒溫CO2培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo公司</p>&l

61、t;p>　　精密電子分析天平（BP221S） 美國(guó)scwtorius公司</p><p>　　智能低速離心涂片機(jī)（SYIOspin4） 美國(guó)Thermo公司</p><p>　　低溫梯度離心機(jī)（Mikro 22R） 美國(guó)Hettich公司MIKRO22R型</p>&

62、lt;p>　　臺(tái)式多用途恒溫離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司</p><p>　　超純水組合系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司</p><p>　　－80℃超低溫冰箱 美國(guó)Thermo公司<

63、;/p><p>　　磁力攪拌器（690-5） 美國(guó)Nahita公司</p><p>　　高級(jí)倒置顯微鏡(AXIOVERT40C) 上海蔡司公司</p><p>　　一次性細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板

64、 美國(guó)Costar公司</p><p>　　臺(tái)式靈敏pH計(jì) 美國(guó)Thermo公司</p><p>　　超凈工作臺(tái)（SKJH） 上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司</p><p>　　高級(jí)制冰機(jī)（SIM-F124） 日本SANYO公司SIM-F124

65、</p><p>　　智能梯度PCR儀 eppendorf公司</p><p>　　Realtime PCR儀 ABI公司7500</p><p>　　紫外分光光度儀　　　　　　　　　　 Eppendorf Biop

66、photometer公司</p><p>　　Maxi Mix　　　　　　　　　　　　 　 美國(guó)Thermo公司</p><p>　　恒溫水浴箱(18007A-ICEQ)　　　　　　　 Barnsteadl labline公司</p><p>　　熒光顯微鏡（BX51）

67、 日本Olympus公司</p><p>　　－20℃低溫冰箱(3782-ICE) 美國(guó)Thermo公司</p><p>　　4℃冰箱　　　　　　　　　　 　 中國(guó)海爾公司</p><p>　　紫外線燈（SJC-2）

68、 北京海淀空后高溫復(fù)合材料廠</p><p>　　微量移液器　 法國(guó)GILSON公司</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　第一部分 正常小鼠骨髓初始MDSCs分離和純化</p><p>　　正常小鼠骨髓初始MDS

69、Cs(CD11b+細(xì)胞)的免疫磁珠分選</p><p>　　1.1 取小鼠雙下肢股骨和脛骨，使用2ml注射器吸取stanining buffer沖出骨髓細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液； </p><p>　　1.2 CD11b免疫磁珠分選骨髓CD11b+細(xì)胞（陽(yáng)選法）</p><p>　　1.2.1取骨髓單細(xì)胞懸液4ml計(jì)數(shù)，離心棄上清（1200rpm，5min），按照每10

70、7細(xì)胞加90µl staining buffer和10µLCD11b+MicroBeads, 4℃避光孵育15分鐘。</p><p>　　1.2.2 3ml stanining buffer洗一遍（2000rpm，10分鐘），棄上清，加入3ml stanining buffer重懸，按照美天旎免疫磁珠的說(shuō)明書(shū)，使用MACS手動(dòng)分選CD11b+細(xì)胞。</p><p>　　

71、1.2.3 取分選后的CD11b+細(xì)胞，加入Percp Cy5.5標(biāo)記的CD11b抗體和PE標(biāo)記的Gr1抗體， 4℃避光孵育15分鐘，離心棄上清（1200rpm，5min），加200µl staining buffer 重懸，流式細(xì)胞儀分析，檢測(cè)分選的CD11b+細(xì)胞純度。</p><p>　　正常小鼠骨髓初始MDSCs（CD11b+細(xì)胞）形態(tài)學(xué)分析</p><p>　　2.1

72、分離純化：取正常小鼠骨髓細(xì)胞懸液，方法同前，2 ml stanining buffer洗一遍，用CD11b+MicroBeads陽(yáng)選CD11b+陽(yáng)性細(xì)胞。</p><p>　　2.2 性質(zhì)鑒定：將FACS Aira分選出的CD11b+細(xì)胞取80000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行離心涂片，Wright-Giemsa染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。</p><p>　　2.2.1 將分選到的80000 CD11b+細(xì)胞的懸

73、液，離心（1200 rpm，5min），棄上清，加入200 μl staining buffer重懸細(xì)胞；</p><p>　　2.2.2組裝離心涂片設(shè)備放入離心涂片機(jī)；</p><p>　　2.2.3將200μl細(xì)胞懸液加入離心涂片管中，室溫離心（750 rpm， 5min）；</p><p>　　2.2.4取出載玻片，靜置5 分鐘晾干；</p>&

74、lt;p>　　2.2.5滴加瑞氏姬姆薩染液A液約6至10滴，輕輕吹勻，使其充分與玻片上的細(xì)胞接觸，室溫作用1分鐘；</p><p>　　2.2.6 按1:1體積加入瑞氏姬姆薩染液B液，迅速將吹勻，室溫作用10分鐘；</p><p>　　2.2.7用純凈水沖洗多余染色液，晾干之后即可于油鏡下觀察及拍攝細(xì)胞圖像。</p><p>　　正常小鼠骨髓初始MDSCs對(duì)C

75、D4+T或CD8+T細(xì)胞增殖的體外抑制作用檢測(cè)</p><p>　　3.1 抗原非特異性T細(xì)胞增殖：</p><p>　　取各組小鼠骨髓細(xì)胞分選出CD11b+細(xì)胞分別與正常小鼠脾臟初始CD4+或CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)，將T細(xì)胞以1×105/孔的密度接種到96孔板中，每孔CD11b+細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞比例按1:1、1:2、1:4及1:8培養(yǎng)，檢測(cè)骨髓CD11b+細(xì)胞抑制淋巴細(xì)胞增殖

76、的能力。每孔加1µl DynaBeads CD3/28 T-Activator刺激T細(xì)胞活化，正常小鼠脾CD4+或CD8+細(xì)胞預(yù)先用CFSE標(biāo)記，培養(yǎng)72小時(shí)，用APC標(biāo)記的CD4或APC標(biāo)記的CD8抗體染色，7-AAD標(biāo)記死亡細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析淋巴細(xì)胞增殖情況。增殖指數(shù)計(jì)算公式：增殖指數(shù)（Proliferation Index）=共培養(yǎng)的T細(xì)胞增殖百分比（ Proliferation Percentage of T cel

77、ls with MDSCs）/陽(yáng)性對(duì)照T細(xì)胞增殖百分比 (Proliferation Percentage of T cells without MDSCs）。</p><p>　　3.2免疫磁珠分選CD4+T或CD8+T細(xì)胞（陰選法）： </p><p>　　3.2.1制備小鼠脾細(xì)胞單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，每107細(xì)胞加入40µl的staining buffer和10µl

78、CD4 Anti-Biotin cocktail , 渦旋混勻，4℃避光孵育15分鐘。每107細(xì)胞再加入30µl的staining buffer和10µl的CD4 MicroBeads，渦旋混勻，4℃冰箱避光孵育15分鐘；</p><p>　　3.2.2 加入4ml staining buffer洗滌細(xì)胞，離心（2000rpm ，10min），棄上清，加500µl staining

79、buffer重懸細(xì)胞；</p><p>　　3.2.3根據(jù)分選前總細(xì)胞數(shù)目，選擇相應(yīng)的LS或MS分選柱(LS柱可容納109總細(xì)胞；MS柱可容納108總細(xì)胞)；</p><p>　　3.2.4 LS或MS分選柱每次加staining buffer洗柱的體積分別為3ml和0.5ml，最終收集目的細(xì)胞的洗脫液量分別為5ml和2ml。以LS柱為例：將3ml staining buffer加入分選柱

80、中潤(rùn)柱，staining buffer流空后加入細(xì)胞懸液，同時(shí)準(zhǔn)備收集目的細(xì)胞。取3ml staining buffer洗脫分選柱目的細(xì)胞，重復(fù)3次。所收集的陰性細(xì)胞即CD4＋T或CD8+T細(xì)胞，離心（1200rpm，5min）。</p><p>　　3.2.5 加入4ml staining buffer重懸分選的目的細(xì)胞，取出10µl稀釋10倍計(jì)數(shù)，其余做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。</p><p

81、>　　3.3 CD4+T或CD8+T細(xì)胞CFSE染色[25,26]：</p><p>　　3.3.1 使用2ml含5%FBS的1×PBS染色液重懸CD4+T細(xì)胞；</p><p>　　3.3.2 加0.2µl CFSE（濃度為5µmol/ml），蓋緊流式管，反復(fù)快速混勻，室溫避光孵育5分鐘；</p><p>　　3.3.3 加

82、入4ml終止液（含20%FBS的1×PBS），離心（1200rpm， 5min），棄上清，重復(fù)一次；</p><p>　　3.3.4 2ml 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，離心（1200rpm， 5min），棄上清，計(jì)數(shù)后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。</p><p>　　正常小鼠骨髓MDSCs(CD11b+細(xì)胞)對(duì)小鼠急性肝衰竭（Acute Hepatic Failure;AHF）模型體內(nèi)免疫抑制作用的檢

83、測(cè)</p><p>　　4.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組</p><p><b>　　4.1.1 動(dòng)物：</b></p><p>　　Gfi1:GFP基因敲入C57 BL /6J小鼠（Gfi1:GFP-/+），雄性，6～8周，體重約20±1g，加拿大蒙特利爾大學(xué)Tarik Moroy教授實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送，飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。PCR法進(jìn)行基

84、因型鑒定，流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP進(jìn)行再次確認(rèn)。</p><p>　　野生型C57BL/6J小鼠，雄性、6～8周、體重約20±1g購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。</p><p><b>　　4.1.2 分組：</b></p><p>　　對(duì)照組：100µl 1×PBS 眼球后注射 10只</p><

85、;p>　　處理組：100µl 細(xì)胞懸液（含1×106 MDSCs）眼球后注射10只</p><p>　　4.2 小鼠急性肝衰竭（Acute Hepatic Failure;AHF）造模方法：</p><p>　　用D-半乳糖胺（D-GalN）(400mg/kg)/LPS(0.5mg/kg)劑量造模。D-GalN/LPS混合液調(diào)整體積500µl腹腔注射，腹

86、腔注射的體積25ml/kg計(jì)算。</p><p>　　4.3 細(xì)胞分離純化及各組的處理方法</p><p>　　按上述1的免疫磁珠方法分離骨髓混合MDSCs (CD11b+ cells), 對(duì)照組：100µl 1×PBS 眼球后注射，處理組：100µl （含1×106 MDSCs）眼球后注射，以上兩組注射后2小時(shí)制備急性肝衰竭模型。</p>

87、;<p>　　4.4 觀察小鼠12小時(shí)生存率，繪制生存曲線</p><p>　　第二部分：正常小鼠骨髓初始MDSCs亞群的分離純化</p><p>　　正常小鼠骨髓初始MDSCs亞群的分群和流式分選</p><p>　　無(wú)菌操作分離小鼠下肢股骨和脛骨，使用2ml注射器吸取stanining buffer沖出骨髓細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液；</p>

88、<p>　　取106上述的單細(xì)胞懸液，100µl stanining buffer重懸，加入Percp Cy5.5標(biāo)記的CD11b抗體和PE標(biāo)記的Gr1的抗體，4℃避光孵育15分鐘，2毫升staining buffer 離心（1200rpm,5min），棄上清，200µl staining buffer重懸，流式細(xì)胞儀分析和分選。</p><p>　　正常小鼠骨髓MDSCs亞群的

89、形態(tài)學(xué)分析</p><p>　　分離純化：制備正常小鼠骨髓單細(xì)胞懸液，方法同前，2 ml stanining buffer洗一遍，用抗CD11b microbeads陽(yáng)選CD11b+陽(yáng)性細(xì)胞即為混合MDSCs。加入Percp-Cy5.5標(biāo)記的CD11b抗體和PE標(biāo)記的Gr1抗體，避光孵育15分鐘，2 ml stanining buffer洗一遍，應(yīng)用流式細(xì)胞分選儀從混合MDSCs分選CD11blowGr1low

90、GFP- (M1)、CD11blowGr1lowGFP+（G1）、 CD11blow Gr1high GFP+ (G2)和 CD11bhigh Gr1high GFP+ (G3)四個(gè)亞群細(xì)胞。</p><p>　　性質(zhì)鑒定：將流式細(xì)胞儀（BD FACS Aira）分選出的骨髓初始MDSCs亞群分別取80000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行離心涂片，Wright-Giemsa染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。</p><p>

91、;　　分別將分選后四個(gè)亞群的80000個(gè)細(xì)胞重懸在200µl staining buffer。離心涂片后Wright Giemsa染色后觀察及拍攝細(xì)胞圖像（詳細(xì)步驟見(jiàn)實(shí)驗(yàn)方法的第一部分）。</p><p>　　第三部分：正常小鼠骨髓初始MDSCs亞群表型和功能的檢測(cè)</p><p>　　1．正常小鼠骨髓初始MDSCs及亞群的比例檢測(cè)</p><p>　　取

92、小鼠雙下肢股骨，使用2ml注射器吸取stanining buffer沖出骨髓細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液；</p><p>　　取106上述的單細(xì)胞懸液，100µl重懸，使用Percp Cy5.5標(biāo)記的CD11b抗體和PE標(biāo)記的Gr1的抗體染色，4℃避光孵育15分鐘，2毫升staining buffer 洗一遍（1200rpm,5min），200µl重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，F(xiàn)lowjo V5.6.7軟件

93、分析。</p><p>　　2．正常小鼠骨髓初始MDSCs亞群表型的鑒定</p><p><b>　　2.1 取材及染色</b></p><p>　　取小鼠雙下肢股骨，使用2ml注射器吸取stanining buffer沖出骨髓細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，離心棄上清（1200rpm ，5min）；取107 細(xì)胞染色,均分為10份。</p>

94、<p>　　取上述4份骨髓細(xì)胞，分別加入CD11b-Percp Cy5.5、 Gr1-APC和CD124-PE或CD210-PE或TLR-2-PE或TLR-4-PE熒光抗體，4℃避光孵育15分鐘，2ml stanining buffer洗一遍，離心棄上清（1200rpm ，5min），加入200µl stanining buffer流式檢測(cè)骨髓初始MDSCs亞群的表型差異。</p><p>

95、;　　取6份骨髓細(xì)胞懸液，分別染CD11b-Percp Cy5.5、 Gr1-PE和CD62L-APC、Ly6c -APC、CD204-APC、CD206-APC、CD80-APC、CD86-APC抗體，4℃避光孵育15分鐘，2ml stanining buffer洗一遍，離心棄上清（1200rpm ，5min），加入200µl stanining buffer，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)骨髓naiveMDSCs亞群的表型差異。<

96、/p><p>　　3．正常小鼠骨髓初始MDSCs亞群的體外功能的檢測(cè)</p><p>　　3.1 骨髓初始MDSCs不同的亞群對(duì)CD4+或CD8+T細(xì)胞增殖的影響</p><p>　　抗原非特異性T細(xì)胞增殖：分離制備正常小鼠骨髓單細(xì)胞懸液，分選出的M1、G1、G2和G3四個(gè)亞群細(xì)胞分別與正常小鼠脾臟初始CD4+或CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)，將T細(xì)胞以1×105/孔加

97、至96孔板中，每孔骨髓初始MDSCs亞群細(xì)胞與T細(xì)胞的比例按1:1、1:2、1:4及1:8培養(yǎng)，每孔加2µl Dynabeads CD3/28 T-Activator刺激T細(xì)胞活化，T細(xì)胞預(yù)先用CFSE標(biāo)記；培養(yǎng)72小時(shí)，分別用APC標(biāo)記的CD4或CD8抗體染色，7-AAD標(biāo)記死亡細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)和分析M1、G1、G2和G3細(xì)胞抑制淋巴細(xì)胞增殖的能力。增殖指數(shù)計(jì)算公式見(jiàn)實(shí)驗(yàn)方法的第一部分。</p><p

98、>　　3.2免疫磁珠分選CD4+T或CD8+T細(xì)胞（陰選法）： </p><p>　　3.2.1 制備正常小鼠脾細(xì)胞單細(xì)胞懸液，分別應(yīng)用德國(guó)美天旎公司的免疫磁珠陰選試劑盒分選CD4+或CD8+T細(xì)胞，（詳細(xì)方法見(jiàn)第一部分）。</p><p>　　3.2.2 4ml staining buffer重懸分選出的細(xì)胞，取出10µl計(jì)數(shù)，其余做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。</p>&

99、lt;p>　　3.3 CD4+T或CD8+T細(xì)胞CFSE染色：</p><p>　　將分選后的CD4+T或CD8+T細(xì)胞用CFSE標(biāo)記后計(jì)數(shù)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)（詳細(xì)方法見(jiàn)第一部分）。</p><p>　　第四部分 正常小鼠骨髓初始MDSCs亞群對(duì)CD4+T和CD8+T細(xì)胞增殖抑制作用機(jī)制的初步探討</p><p>　　1．正常小鼠骨髓初始MDSCs亞群的細(xì)胞因子

100、及Arg?、NOS2兩種酶實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)</p><p>　　分選出各組小鼠骨髓M1、G1、G2和G3亞群細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR法（Real-time PCR），從mRNA表達(dá)水平檢測(cè)IL-4、IL-10、IL-13、IFN-γ、TNF-α、TGF-β1以及ArgI、NOS2在初始MDSCs不同亞群細(xì)胞中的表達(dá)。探討M1、G1、G2和G3亞群細(xì)胞抑制CD4+T或CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng)的機(jī)制。</p>

101、;<p>　　Realtime-PCR實(shí)驗(yàn)：</p><p>　　1.1 純化細(xì)胞總RNA（德國(guó)QiaGen公司的RNeasy Mini Kit）</p><p>　　1.1.2 將流式細(xì)胞分選儀分選的骨髓初始MDSCs四個(gè)亞群細(xì)胞用4ml PBS 重懸，離心（1200 rpm，5min），棄上清；</p><p>　　1.1.3 加350 μl RL

102、T buffer細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，反復(fù)吹打至細(xì)胞懸液透亮；</p><p>　　1.1.4 將裂解后的細(xì)胞懸液加至DNA eliminator spin column中，高速離心（13000 rpm ，30s）；</p><p>　　1.1.5 棄DNA eliminator spin column，在濾液中加350μl 70%酒精（RNase-free），用移液器輕輕吹勻；</p

103、><p>　　1.1.6 將上述700µl濾液加至RNase-free spin column，高速離心（13000rpm 15s），棄濾液；</p><p>　　1.1.7 向RNase-free spin column中加700 μl buffer RW1洗滌RNA，高速離心（13000 rpm 15s），棄濾液；</p><p>　　1.1.8 向RNa

104、se-free spin column中加500μl buffer RPE洗滌RNA，高速離心（13000 rpm 15s），棄濾液；</p><p>　　1.1.9 重復(fù)步驟7。高速離心（13000 rpm，2 min），洗滌RNA；</p><p>　　1.1.10將RNase-free spin column，放置在采集管中加RNase-free water 30μl 溶解RNA，高

105、速離心（13000 rpm，1min），收集RNA溶液；</p><p>　　1.1.11取1μl RNA溶液用RNase-free water稀釋50倍，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA含量。方法如下：比色杯中加入50 μl RNase-free water校正紫外分光光度計(jì)歸零，測(cè)定RNA樣品的OD 260/OD 280,計(jì)算RNA的濃度（μg/ml），以O(shè)D260/OD280判斷RNA樣品中有無(wú)蛋白質(zhì)等物質(zhì)混雜

106、。提取的RNA純度用A260/A280的值表示，比值再1.8～2.0范圍內(nèi)為RNA，方可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。</p><p>　　逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse Transcription-PCR ；RT-PCR）（使用美國(guó)ABI公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒）</p><p>　　1.2.1 每20 μl反應(yīng)體系加總RNA量必須大于等于2 µg；</p><p>　　

107、1.2.2 在無(wú)RNA酶的操作室進(jìn)行，冰上加樣，反應(yīng)體系如下：</p><p>　　1.2.3 使用梯度PCR儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，條件如下：</p><p>　　1.3 實(shí)時(shí)熒光定量-PCR（Realtime-PCR）</p><p>　　1.3.1 Realtime-PCR反應(yīng)體系（反應(yīng)體積20μl）如下：</p><p>　　1.3.2

108、使用美國(guó)ABI 7500 Realtime-PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件如下：</p><p>　　1.4 ABI SDS 7500 software分析結(jié)果。</p><p>　　2．精氨酸激酶I（Arg?）、一氧化氮合酶2（NOS2）和一氧化氮合酶（NOS）抑制劑阻斷骨髓初始MDSCs亞群對(duì)T細(xì)胞增殖抑制作用</p><p>　　2.1抗原特異性T細(xì)胞增殖：&l

109、t;/p><p>　　制備正常小鼠骨髓單細(xì)胞懸液，方法同第一部分。分選出M1、G1、G2和G3四個(gè)亞群細(xì)胞與正常小鼠脾臟初始CD4+T或CD8+T細(xì)胞在96孔板中共培養(yǎng)，T細(xì)胞每孔1×105細(xì)胞，每孔骨髓初始MDSCs亞群細(xì)胞與T細(xì)胞的培養(yǎng)比例為1:1，每一孔加入2µl DynaBeads CD3/28 T-Activator刺激T細(xì)胞活化，正常小鼠脾淋巴細(xì)胞預(yù)先以CFSE標(biāo)記以觀測(cè)其增殖情況，檢