體外T細(xì)胞活化與輸血免疫抑制的機(jī)理研究.pdf

1、輸血引起的受血者機(jī)體免疫力下降，在臨床Meta分析中已肯定其可導(dǎo)致受血者腫瘤復(fù)發(fā)率與術(shù)后感染率增加。我們從初期應(yīng)答細(xì)胞APC入手，研究T淋巴細(xì)胞激活的免疫功能變化。如果APC遞呈的抗原功能障礙，可使整個(gè)T細(xì)胞增殖抑制；如果增加APC的數(shù)量，將擴(kuò)大T細(xì)胞增殖反應(yīng)的強(qiáng)度。利用CD3/28雙抗體模擬第一、二信號(hào)的變化探討免疫上下調(diào)節(jié)的可能機(jī)制，為我們研究輸血帶來(lái)的免疫影響及如何糾正提供可依靠的線索。 1.各血液成份及游離血紅蛋白對(duì)雙向

2、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的抑制作用利用雙向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)技術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及3H胸腺嘧啶(3H-TdR)摻入法，將壓積紅細(xì)胞(PRBC)、去白PRBC和游離血紅蛋白，按不同濃度比例加入MLR體系，及增加單核細(xì)胞濃度，即利用其體外抗原提呈功能，以PBMC(正常APC)的MLR為陰性對(duì)照，以環(huán)胞A為陽(yáng)性對(duì)照，計(jì)算上述因素對(duì)MLR的抑制率。隨著PRBC、游離血紅蛋白劑量的增加，其對(duì)MLR的抑制作用逐漸增強(qiáng)，去除白細(xì)胞后可以減弱這一抑制作用

3、；加入紅細(xì)胞量較大時(shí)，去白PRBC的抑制作用也相對(duì)不明顯。兩倍APC可以明顯減弱紅細(xì)胞、游離血紅蛋白對(duì)MLR的抑制作用。我們得出紅細(xì)胞、粒細(xì)胞和游離血紅蛋白可能通過(guò)干擾APC的提呈功能而抑制MLR，可以應(yīng)用此方法來(lái)解釋及證實(shí)大劑量輸血及去白細(xì)胞輸血的免疫調(diào)節(jié)作用。 2.CD3、CD28抗體增強(qiáng)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的研究研究CD3、CD28抗體對(duì)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的增強(qiáng)作用，以期了解與評(píng)價(jià)應(yīng)用外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)體外擴(kuò)增淋巴細(xì)胞時(shí)雙

4、抗體作用特性及APC數(shù)量對(duì)擴(kuò)增的影響。 利用淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)3H-胸腺嘧啶(3H-TdR)摻入法、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及流式細(xì)胞術(shù)(FCM)，以包被CD3抗體、CD28抗體誘導(dǎo)PBMC中淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增加APC濃度，以CD3抗體刺激PBMC(正常APC)中淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為對(duì)照，以各組刺激指數(shù)(SI)來(lái)計(jì)算各因素對(duì)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響，及分析CD8+CD25+細(xì)胞占總轉(zhuǎn)化細(xì)胞的百分比變化。正常APC濃度的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化組，CD3抗體可增加淋巴細(xì)

5、胞轉(zhuǎn)化，CD28抗體有協(xié)同作用；去APC組，CD3抗體增強(qiáng)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用明顯下降，CD28抗體仍有協(xié)同作用；4倍APC組，CD3抗體可以明顯增強(qiáng)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用，CD28抗體協(xié)同作用不明顯。CD28抗體單獨(dú)無(wú)增加淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用。流式細(xì)胞儀結(jié)果與SI結(jié)果平行。因此我們認(rèn)為CD28抗體可協(xié)同CD3抗體模擬體內(nèi)第一、二信號(hào)增強(qiáng)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，CD28可替代APC的第二信號(hào)作用，但APC有其它獨(dú)立活化淋巴細(xì)胞的作用。 3.CD28

6、抗體協(xié)同CD3抗體活化的T細(xì)胞功能研究利用抗CD3、CD28抗體模擬第一、二信號(hào)在體外作用于人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，研究其對(duì)T細(xì)胞活化的功能。用3H-TdR法測(cè)定CD3、CD28抗體對(duì)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的功能，用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)測(cè)定增殖活化后T細(xì)胞的免疫表型變化及T細(xì)胞激活后CD154的表達(dá)，酶聯(lián)免疫測(cè)定細(xì)胞因子γ干擾素(IFN-γ)的分泌水平，ELISPOT測(cè)定單個(gè)細(xì)胞IFN-γ、IL-2分泌表達(dá)，及RT-PCR測(cè)定Fas、Fo

7、xp3、TGFβ1和LAG3基因mRNA表達(dá)水平。CD3、28抗體協(xié)同作用PBMC后其刺激指數(shù)(SI)明顯優(yōu)于單獨(dú)使用CD3抗體，CD28抗體單獨(dú)使用無(wú)刺激作用；不同濃度包被的搭配刺激作用強(qiáng)弱不同。流式細(xì)胞儀(FCM)結(jié)果顯示單獨(dú)CD28抗體組無(wú)活化作用，CD3抗體組和CD3/28抗體組CD4+CD25、CD8+CD25+百分率均有不同程度的升高，CD154表達(dá)輕微上升；CD3抗體組IFN-γ上升緩慢且持續(xù)時(shí)間短，CD3/28抗體組IF

8、N-γ水平上升早且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)；ELISPOT顯示CD3/28抗體組IFN-γ、IL-2均表達(dá)較強(qiáng)，F(xiàn)as、TGFβ1基因mRNA表達(dá)水平下調(diào)，F(xiàn)oxp3、LAG3基因mRNA表達(dá)風(fēng)度值過(guò)低無(wú)法檢測(cè)。CD28抗體可能通過(guò)下調(diào)抑制T細(xì)胞活化的基因，或增強(qiáng)某些活化基因的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)T細(xì)胞充分活化，使具有殺傷活力的CD8+CD25+數(shù)質(zhì)量增加，免疫向Th1偏移，從而增強(qiáng)了機(jī)體細(xì)胞免疫力。從側(cè)面證明輸血產(chǎn)生的負(fù)向調(diào)節(jié)使IFNγ、IL-2表達(dá)下降，T