二、三倍體虹鱒Oncorhynchus mykiss外周血紅細胞及造血器官中PCNA的表達.pdf

1、增殖細胞核抗原（PCNA）是僅存在于增殖細胞的細胞核中的一類蛋白質(zhì)，通常被用作細胞增殖的標記物。通過對虹鱒外周血及造血器官中PCNA表達的定位研究，可以確定外周血紅細胞及造血器官中細胞的增殖能力，從而為魚類多倍體紅細胞研究提供基礎(chǔ)資料。
　　 本試驗觀察并對比了二、三倍體虹鱒Oncorhychus，mykiss（Walbaum）外周血紅細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)的差異；運用免疫細胞化學(xué)方法、免疫組織化學(xué)方法檢測外周血紅細胞中是否存在增殖細胞

2、核抗原（PCNA）的表達并對其進行了定位研究。運用流式細胞術(shù)對外周血紅細胞PCNA的表達量進行了定量研究；檢測了二三倍體虹鱒外周血中S期紅細胞所占比例；對造血器官中PCNA的表達進行了定位研究，確定了造血組織的分布及各器官造血的活躍程度。試驗結(jié)果表明：
　　 1.三倍體虹鱒外周血紅細胞與二倍體相比較體積較大，細胞形態(tài)更為細長。三倍體紅細胞及其細胞核的體積分別為二倍體的1.49倍和1.50倍，與理論值1.50倍相符合。在三倍體虹鱒

3、外周血中可見一定比例的畸形紅細胞，可以大概分為縊痕瓔、啞鈴型和不規(guī)則型。這些畸形細胞在二倍體中也有少量存在，但比例極小。二、三倍體中畸形細胞的比例分別為0.08％和8.5％。在二、三倍體的外周血液中還可見一定比例的未成熟紅細胞，分別占紅細胞總數(shù)的8％和11.9％，二、三倍體之間差異極顯著。
　　 2.通過光學(xué)顯微鏡觀察免疫組織化學(xué)染色后二、三倍體的紅細胞中有棕黃色沉淀附著的PCNA陽性染色細胞占整個紅系細胞總數(shù)的0.20/0和6

4、.4％（試驗所用抗體為小鼠抗PCNA單克隆抗體（克隆號：PC10））。陽性染色細胞的形態(tài)與未成熟紅細胞的形態(tài)一致或相近。三倍體中呈PCNA陽性的細胞約占未成熟紅細胞總數(shù)的57.9％。而二倍體中PCNA陽性細胞數(shù)量極少，僅占未成熟紅細胞數(shù)的2.5％。
　　 3.流式細胞儀檢測二、三倍體外周血液中紅細胞處于S期的細胞比例分別為0.68％和4.05％，差異極顯著。通過熒光抗體標記并進行流式細胞儀檢測得到一二、三倍體中有PCNA陽性表達

5、的紅細胞比例分別為0.37％和8.390％，差異極顯著。
　　 4.抗PCNA單克隆抗體（PCIO）可以與細胞中增殖細胞核抗原特異性結(jié)合，通過蛋白質(zhì)電泳檢測出一條由免疫反應(yīng)產(chǎn)生的35-36kDa的蛋白質(zhì)條帶。并且可以看出，抗PCNA單克隆抗體（PC10）可以與大鼠脾臟，以及虹鱒肝臟、腎臟和三倍體外周血細胞發(fā)生交叉反應(yīng)，其可用于對虹鱒增殖細胞核抗原的檢測。
　　 5.采用TUNEL法檢測虹鱒外周血中的凋亡細胞，無論二倍體還

6、是三倍體的外周血中均有呈棕黃色染色的凋亡細胞，但這些細胞屬于血液中自然凋亡細胞?；渭t細胞在TUNEL檢測中并未表現(xiàn)出凋亡細胞所應(yīng)有的棕黃色沉淀，所以它們不是凋亡細胞。從而排除了畸形細胞產(chǎn)生的一種可能性即細胞凋亡。
　　 6.檢測虹鱒造血器官中PCNA的表達可知，頭腎中大量造血祖細胞集中分布于血竇內(nèi)并且呈較強的PCNA陽性。造血祖細胞在頭腎組織中也有廣泛分布，并且增殖活躍。在腎臟中，PCNA陽性細胞均勻分布丁二腎小管和集合管之間