小黑楊抗真菌病轉(zhuǎn)基因的研究.pdf

1、本文以小黑楊作為轉(zhuǎn)基因的受體材料，研究了不同預(yù)培養(yǎng)時間、工程菌液濃度、浸染時間、共培養(yǎng)時間以及篩選方法對其遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響。 幾丁質(zhì)酶是植物在受到病原菌侵染時所表達出的一組蛋白質(zhì)，可以水解構(gòu)成真菌(除卵菌外)細胞壁的主要組成成分幾丁質(zhì)，從而抑制真菌的生長。 以MS+0.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA為分化培養(yǎng)基、WPM+0.4mg/LIBA為生根培養(yǎng)基，以外源的幾丁質(zhì)酶基因為目的基因，在此基礎(chǔ)上進行了小黑楊的

2、遺傳轉(zhuǎn)化研究，通過葉片及組培苗莖段的敏感性試驗，最終確定葉片分化時卡那霉素的臨界濃度為40mg/L，芽誘導(dǎo)生根時卡那霉素的臨界濃度為20mg/L，抑菌抗生素頭孢唑林鈉700mg/L的濃度不會對小黑楊葉片分化及生根培養(yǎng)產(chǎn)生不利影響。成功摸索出農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小黑楊遺傳轉(zhuǎn)化體系：選取生長20d左右的健壯的小黑楊組培苗葉片，通過主葉脈剪2～3下，預(yù)培養(yǎng)3～4d；將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的農(nóng)桿菌(OD600=0.5)離心后用液體MS培養(yǎng)基或無菌蒸餾水稀釋

3、成OD600=0.3～0.4濃度，進行浸染；侵染時間為6～15min；共培養(yǎng)3d后，轉(zhuǎn)入到篩選培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)不定芽及生根階段的卡那霉素連續(xù)篩選(含有40mg/L卡那霉素和700mg/L的頭孢唑林鈉)。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將外源幾丁質(zhì)酶基因?qū)氲叫『跅钪?，為小黑楊的遺傳轉(zhuǎn)化及抗性育種提供了理論基礎(chǔ)。 其中一部分轉(zhuǎn)化苗通過PCR分子檢測，有13株出現(xiàn)了特異性擴增條帶，而陰性對照沒有特異性條帶產(chǎn)生；通過PCR-Southern的進一步分