地克珠利對柔嫩艾美耳球蟲乳酸脫氫酶特性的影響研究.pdf

1、柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella，Et)是隸屬于頂器復(fù)合門(Apicomplexa)艾美耳屬的一種胞內(nèi)寄生性原蟲，可引起雞急性盲腸球蟲病，嚴重時可致雞只死亡。目前球蟲病的控制主要依賴抗球蟲藥物預(yù)防。地克珠利是一種三嗪類化合物，具有高效、低毒、廣譜的抗球蟲效力，但若長期使用或使用不當，會出現(xiàn)耐藥性。要防止或延緩耐藥性的發(fā)生，以及研制新的有效藥物，就必須了解該藥抗寄生蟲的分子作用機制，確定其靶標分子。至今，關(guān)于地克珠利抗球蟲的

2、分子作用機制還不清楚。乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)是糖酵解途徑的末端酶，能夠催化丙酮酸與乳酸之間可逆的氧化還原反應(yīng)，大多數(shù)體內(nèi)寄生蟲依靠此途徑獲取能量維持生存。研究表明，E tenella地克珠利敏感株LDH（sEtLDH）與耐藥株LDH（rEtLDH）的同工酶譜存在明顯差異，提示EtLDH與地克珠利抗球蟲作用機理存在一定聯(lián)系。本研究通過sEtLDH與rEtLDH特性的差異比較、地克珠利對E.tene

3、lla孢子生殖及裂殖生殖過程中LDH的影響研究，為揭示地克珠利的分子作用機理及尋找潛在的藥物靶標奠定了重要基礎(chǔ)。
　　1.EtLDH單克隆抗體的制各及其在蛋白定位中的應(yīng)用
　　用大腸桿菌表達的重組EtLDH可溶性蛋白免疫BALB/c小鼠，經(jīng)5次免疫后取脾臟制備免疫脾細胞，與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0融合，用間接ELISA法篩選陽性雜交瘤細胞，經(jīng)3次亞克隆后獲得2株能穩(wěn)定分泌EtLDH單克隆抗體的雜交瘤細胞株2F7和2H4，抗體

4、亞類鑒定均為IgG1，腹水效價分別為1∶8000和1∶64000。Western blot檢測顯示2F7單抗能識別E.tenella第二代裂殖子中大小約為35 KDa的天然蛋白，利用該單抗對EtLDH在Etenella第二代裂殖子中的分布進行定位，結(jié)果顯示EtLDH主要分布于裂殖子的細胞質(zhì)。研究表明成功制備了EtLDH單克隆抗體，為深入研究EtLDH的功能和特性奠定了基礎(chǔ)。
　　2.柔嫩艾美耳球蟲地克珠利敏感株與耐藥株LDH特性的

5、差異研究
　　克隆rEtLDH蛋白編碼區(qū)(Coding sequence，CDS)，經(jīng)測序和生物信息學(xué)分析，rEtLDH CDS為996 bp，編碼331個氨基酸，與sEtLDH僅在第914位有1個堿基的差異，編碼蛋白僅在第305位有1個氨基酸的差異;熒光定量PCR結(jié)果顯示，在球蟲4個不同發(fā)育階段（未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子）中，rEtLDH mRNA的相對含量在子孢子階段最高，且每個階段中sEtLDH mRN

6、A的相對含量都明顯高于相應(yīng)的rEtLDH(P＜0.01);Western blot結(jié)果表明，rEtLDH蛋白在第二代裂殖子階段的相對表達量比sEtLDH下降了55.32％(P＜0.01);建立了EtLDH催化反應(yīng)體系，正、逆反應(yīng)的最適溫度分別是50℃、40℃，最適pH分別為6.00、7.00，rEtLDH在孢子化卵囊的催化活力是sEtLDH的78.66％(P＜0.01)。結(jié)果表明，長期的藥物誘導(dǎo)使EtLDH的特性發(fā)生了改變，地克珠利的作

7、用機理可能與LDH參與的糖酵解途徑有關(guān)。
　　3.地克珠利對柔嫩艾美耳球蟲孢子生殖過程LDH的影響研究
　　將純化的未孢子化卵囊平均分成兩組，藥物組用1×10-6地克珠利溶液懸浮后4℃孵育12h，對照組用等體積溶劑做相同處理。離心洗滌后，各組卵囊進行孢子化培養(yǎng)72 h。孢子化實驗結(jié)果顯示藥物組卵囊的孢子化率為對照組的66.32％(P＜0.01);酶活力測定結(jié)果顯示藥物組EtLDH氧化反應(yīng)催化活力為對照組的44.39％(P＜0

8、.01)，而還原反應(yīng)催化活力為對照組的115.76％(P＜0.01);熒光定量PCR結(jié)果顯示藥物組EtLDH基因的轉(zhuǎn)錄水平為對照組的59.18％(P＜0.01);Western blot結(jié)果顯示藥物組EtLDH蛋白的翻譯水平為對照組的80.39％(P＜0.05)。推測地克珠利通過抑制糖酵解途徑中LDH的基因表達及酶活力來抑制球蟲的孢子生殖。
　　4.地克珠剩對柔嫩艾美耳球蟲裂殖生殖過程LDH的影響研究
　　將新鮮的孢子化卵囊

9、接種2周齡無球蟲雞，并分為藥物組和對照組。接種后第4d，藥物組按1 mg/kg體重的劑量嗉囊灌服地克珠利溶液，對照組嗉囊灌服相同劑量的藥物溶劑，繼續(xù)正常飲水采食。收集純化第二代裂殖子，酶活力測定結(jié)果顯示藥物組EtLDH氧化反應(yīng)催化活力為對照組的37.66％(P＜0.01)，而還原反應(yīng)催化活力為對照組的52.01％(P＜0.05);熒光定量PCR結(jié)果顯示藥物組EtLDH基因的轉(zhuǎn)錄水平為對照組的21.15％(P＜0.01); Western