柔嫩艾美耳球蟲β-羥酰-ACP：脫水酶生化特性及抑制動力學研究.pdf

1、雞球蟲病是由艾美耳屬的一種或數(shù)種球蟲同時或先后寄生于雞腸道上皮細胞而引起的，可導致養(yǎng)雞業(yè)發(fā)生巨大經(jīng)濟損失的寄生蟲病。實踐證明，抗球蟲藥物使用在雞球蟲病的防治上具有重要作用。但球蟲抗藥性問題限制了現(xiàn)有抗球蟲藥物的有效應用，促使人們不得不尋找新的藥物靶標。雞球蟲的Ⅱ型脂肪酸合成代謝途徑（typeⅡ fatty acidbiosynthesis pathway，F(xiàn)ASⅢ）是一種植物樣的特殊代謝途徑，是研制開發(fā)新型抗球蟲藥物的一個潛在靶位。

2、r>　　 本實驗主要研究EtFASⅡ途徑中脂酰鏈延伸第三步反應過程中起作用的β-羥酰-ACP脫水酶（β-hydrdoxyacyl-ACP dehydrase，HAD）的生化特征，HAD主要催化β-羥酰-ACP脫水生成反-2-烯酰-ACP。本論文首先通過生物信息學方法對柔嫩艾美耳球蟲（E.tenalla）β-羥酰-ACP脫水酶基因（Ethad）進行預測，以柔嫩艾美耳球蟲第二代裂殖子總RNA為模板，用RT-PCR方法成功擴增出長484bp

3、的EtHAD基因部分片段。其編碼的氨基酸序列與其它物種HAD的相似性在30-70％之間，具有兩個保守的活性位點“His”，“Glu”和5個保守基序（motif）（“PHRYPFLLVD”、“GHFP”、“PGVL”、“EALAQ”和“PGD”）。預測的三級結構顯示，與其它物種的HAD具有相同的活性中心。擴增的成熟片段克隆到原核表達載體pET-32a（+），利用E.coli Rosseta（DE3）重組表達系統(tǒng)表達EtHAD的成熟基因片段

4、。培養(yǎng)物37℃培養(yǎng)，當OD600達到0.6時，加入終濃度為1mM的IPTG進行誘導，16℃培養(yǎng)12h后發(fā)現(xiàn)有大量可溶性表達，并利用Ni-NTA進行純化。
　　 純化pET-32a（+）-EtHAD表達的重組蛋白，制備抗體，利用熒光免疫標記技術研究EtHAD在E.tenella子孢子內(nèi)的亞細胞定位。結果顯示，EtHAD定位于E.tenella子孢子的頂質體。
　　 以丁烯酰-ACP的相類似物丁烯酰-CoA作為底物，進行酶動

5、力學分析，通過底物在紫外光（260nm）吸收的減少來測定反應速率，測得HAD對丁烯酰-CoA的Km值為79.4a±2.96μM，Vmax為0.06985nM/min/μg。抑制動力學分析，發(fā)現(xiàn)兒荼素沒食子酸酯（（-）-catechingallates）、5-羥基-1，4-萘醌（胡桃醌）（Juglone）對EtHAD有一定的抑制作用，其IC50分別為10.5±0.6μM和35.4a±1.0μM。提示EtHAD有可能成為開發(fā)新抗球蟲藥的靶標