電融合與紫外誘導技術在紅景天、蘆薈和草酸青霉菌種質改良上的應用研究.pdf

1、細胞電融合和紫外誘變技術是發(fā)展迅速的細胞工程技術,不僅為核質相互關系、基因調(diào)控等領域的研究提供了有力的手段,而且已成為雜交育種、種質創(chuàng)新的關鍵技術。本論文主要研究原生質體電融合技術與紫外誘變技術在藥用種質如紅景天、蘆薈和草酸青霉菌改良上的應用。
　　 我們開展了蘆薈與紅景天原生質體分離、蘆薈原生質體自體融合及兩物種間原生質體融合的初步探討,優(yōu)化了與原生質體分離和電融合相關的參數(shù),為蘆薈與紅景天的品種改良、優(yōu)化和良種選育提供理論支

2、持與實驗數(shù)據(jù),同時為中藥現(xiàn)代化提供一種新途徑。首先我們優(yōu)化了原生質體酶解條件,蘆薈在2.0％纖維素酶,0.5％果膠酶,0.5％牛白蛋白,0.1％2-氮嗎啉乙磺酸,CPW溶液(含0.6 mol/L甘露醇),pH值為5.6,25±1℃,酶解處理3 h能得到7.03×105個/mL原生質體。而紅景天原生質體的獲得是以黑暗條件下培養(yǎng)10 d的愈傷組織為材料,經(jīng)2.0％纖維素酶,1.0％果膠酶,0.3％離析酶,0.5％牛白蛋白,0.1％MES,C

3、PW溶液(含0.7 mol/L甘露醇),pH值為5.6的酶解液處理3 h,可得到質量較高的原生質體,產(chǎn)量可達2.2×105個/mL。其次對電融合條件進行探討,在交流頻率1 MHz,交流電場強度160V/cm,交流電場作用時間20 s,直流脈沖強度0.9 kV/cm,脈沖次數(shù)為1,幅寬30μs時蘆薈原生質體間的融合較好。利用蘆薈原生質體初步確定融合參數(shù)后,再進一步研究蘆薈與紅景天原生質體間的融合,發(fā)現(xiàn)融合參數(shù)略有不同,交流頻率1 MHz,

4、交流電場強度180 V/cm,交流電場作用時間30 s,直流脈沖強度0.9 kV/cm,脈沖次數(shù)為1,脈沖寬幅30μs時,融合率可達17.9％。
　　 我們以本實驗室從銀杏葉中分離的銀杏內(nèi)生真菌草酸青霉為初始菌株,應用紫外誘變的方法,通過初篩與復篩,得到一株高產(chǎn)纖維素酶的草酸青霉菌突變株PO1M。經(jīng)多次繼代測定酶活,證實該菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性,并在生長形態(tài)、產(chǎn)酶能力及DNA分子水平對初始菌株與突變株進行比較,發(fā)現(xiàn)兩者具有明顯

5、差異。利用RAPD標記,選取10個隨機引物對初始菌株及突變株的DNA樣品分析,發(fā)現(xiàn)引物G02能獲得穩(wěn)定多態(tài)、條數(shù)較多且清晰的條帶,突變株PO1M與初始菌株的條帶具有明顯差異,說明突變株在DNA分子水平上發(fā)生變異。該部分還通過單因素實驗,優(yōu)化了該突變株產(chǎn)酶的最佳液體發(fā)酵條件,最終確定培養(yǎng)基組分為馬鈴薯20.0％,結晶纖維2.0％,蛋白胨0.5％,KH2PO40.3％,MgSO40.15％,維生素B10.001％,自然pH；最佳發(fā)酵條件為溫