青藏高原特有植物墊狀點(diǎn)地梅的種群遺傳結(jié)構(gòu)——基于微衛(wèi)星和葉綠體單倍型分析.pdf

1、青藏書原獨(dú)特的地理特征和氣候變化與該地區(qū)植物物種遺傳多樣性的空間分布格局的形成過(guò)程具有不可分割的聯(lián)系。對(duì)該地區(qū)植物物種的遺傳結(jié)構(gòu)、空間分布格局及其成因的研究能夠增進(jìn)我們對(duì)植物的進(jìn)化和生態(tài)過(guò)程,以及該地區(qū)過(guò)去地質(zhì)氣候變化過(guò)程的理解。以墊狀點(diǎn)地梅(AndrosacetapeteMaxim)為例,它是報(bào)春花科點(diǎn)地梅屬的一種多年生草本植物,分布于高寒草原和高原草甸之上,是地球上海拔分布最高的被子植物之一,同是也是青藏書原上特有的分布最廣,數(shù)量最

2、大的一類墊狀植物,是我們研究物種遺傳多樣性和青臧高原的高寒生態(tài)系統(tǒng)、地質(zhì)和氣候環(huán)境變化歷史事件的理想材料。
　　本文利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記和葉綠體非編碼區(qū)基因序列來(lái)分析墊狀點(diǎn)地梅的遺傳結(jié)構(gòu)和進(jìn)化潛力,評(píng)估墊狀點(diǎn)地梅對(duì)氣候變暖的響應(yīng)能力,探討影響或造成墊狀點(diǎn)地梅空間遺傳結(jié)構(gòu)的生物學(xué)、地質(zhì)事件和氣候環(huán)境變化歷史過(guò)程。旨在通過(guò)對(duì)墊狀點(diǎn)地梅的遺傳多樣性和空間遺傳結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)研究,為更好的保護(hù)和修復(fù)青藏高原高寒的生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能完整性提供有價(jià)

3、值的基礎(chǔ)數(shù)據(jù);結(jié)合青藏高原第四紀(jì)氣候變遷歷史,推測(cè)墊狀點(diǎn)地梅第四冰期的可能避難所以及種群的擴(kuò)散路線,通過(guò)模擬數(shù)據(jù)和墊狀點(diǎn)地梅數(shù)據(jù)分析不同抽樣策略(抽樣大小和抽樣方法)對(duì)研究精細(xì)尺度的空間遺傳結(jié)構(gòu)的影響,為研究墊狀點(diǎn)地梅的繁殖和擴(kuò)散行為提供可靠的方法。主要結(jié)果如下:
　　(1)通過(guò)磁珠富集法篩選墊狀點(diǎn)地梅的微衛(wèi)星分子標(biāo)記基因組DNA后,用Rsal限制性內(nèi)切酶酶切并連接接頭,再用接頭引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到的擴(kuò)增產(chǎn)物與生物素標(biāo)記的(A

4、C)15,(AT)15,(CT)12,(ATC)10和(CCA)10探針雜交,雜交復(fù)合物用鏈親和素包裹磁珠進(jìn)行吸附,得到微衛(wèi)星單鏈目標(biāo)DNA片段,經(jīng)PCR擴(kuò)增,連接PMD19-T載體,轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌,得到微衛(wèi)星富集小插入片段DNA文庫(kù)。經(jīng)陽(yáng)性克隆和測(cè)序分析得到16個(gè)有效的微衛(wèi)星序列,重復(fù)堿基數(shù)以雙核苷重復(fù)最為常見(jiàn),其中又以(GA)n/(CT)n重復(fù)最多,還觀察到ATG、TCT重復(fù)單位。完美型(重復(fù)次數(shù)8～17次)的微衛(wèi)星有9個(gè),占

5、56.25％;非完美型的微衛(wèi)星有5個(gè),占31.25％;混合型的微衛(wèi)星有2個(gè),占12.5％。這些序列在GenBank上的登錄號(hào)分別是:FJ824648～FJ824656、GQ121408～GQ121415。16個(gè)有效的微衛(wèi)星位點(diǎn)成功設(shè)計(jì)了16對(duì)引物,經(jīng)用48個(gè)受試樣本進(jìn)行初步篩選,16對(duì)均表現(xiàn)出多態(tài)性,其中8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)符合Hardy-Weinberg平衡。
　　(2)應(yīng)用6對(duì)微衛(wèi)星引物研究了唐古拉山兩側(cè)的墊狀點(diǎn)地梅種群的遺傳多樣性

6、、遺傳結(jié)構(gòu)和有效種群歷史動(dòng)態(tài)過(guò)程。在8個(gè)采樣種群中,共檢測(cè)到31.8個(gè)等位基因,觀察等位基因數(shù)為3～9.87個(gè),等位基因豐富度為4.484～5.577,平均期望雜合度(HE)為0.579～0.659,平均觀察雜合度(HO)為0.335～0.547,墊狀點(diǎn)地梅總體表現(xiàn)為顯著的雜合子缺失,近交系數(shù)為0.313;在4個(gè)種群中檢測(cè)到連鎖不平衡現(xiàn)象;墊狀點(diǎn)地梅種群間的遺傳分化程度很低,遺傳分化系數(shù)Fst=0.028和Rst=0.026,而且AMO

7、VA結(jié)果表明超過(guò)95％以上遺傳變異發(fā)生在種群內(nèi);雖然8個(gè)種群內(nèi)都發(fā)生了近交繁殖(Fis為0.233～0.430),但墊狀點(diǎn)地梅種群間的基因交流仍很頻繁(Nm＞1),主坐標(biāo)分析、距離法(NJ)和貝斯法(MCMC)的聚類分析結(jié)果顯示墊狀點(diǎn)地梅個(gè)體間混合程度較高,唐古拉山兩側(cè)的墊狀點(diǎn)地梅種群間的基因交流并沒(méi)有受到地理阻礙;用Mantel檢驗(yàn)表明隨著地理距離與遺傳距離之間是顯著相關(guān)的,即能表現(xiàn)出一定的地理隔離(isolationbydistan

8、ce)特征,但用地理距離來(lái)預(yù)測(cè)遺傳距離會(huì)產(chǎn)生很大的誤差。8個(gè)種群中有5個(gè)顯著偏離期望漂移一突變平衡,可能近期經(jīng)歷了瓶頸效應(yīng),位點(diǎn)顯著偏離Hardy-Weinberg平衡,雜合度不足(P＜0.05)以及連鎖不平衡的存在也間接支持這一結(jié)論。但瓶頸效應(yīng)并沒(méi)有顯著影響墊狀點(diǎn)地梅的遺傳多樣性。墊狀點(diǎn)地梅種群內(nèi)較高的遺傳多樣性表明這些瓶頸事件發(fā)生的時(shí)間不是很長(zhǎng),短期瓶頸對(duì)遺傳多樣性影響不大。
　　(3)對(duì)墊狀點(diǎn)地梅的52個(gè)種群414個(gè)體的葉綠

9、體trnL-trnF和rps16基因區(qū)間進(jìn)行了PCR擴(kuò)增片段的全序列測(cè)定,葉綠體trnL-trnF和rps16分別得到12和21個(gè)單倍型,經(jīng)分區(qū)同質(zhì)性檢驗(yàn)后將兩基因合并分析,得到34種單倍型,特有的單倍型占總的單倍型的比例都很高,都達(dá)到58％以上。其中倍型系統(tǒng)發(fā)育樹和Network圖表明52個(gè)種群分為主要分為兩大分支和一小分支,其中一大分支的單倍型主要分布那曲地區(qū)南部與山南地區(qū)北部之間和日喀則地區(qū)的吉隆附近,另一大分支單倍型分布除山南地

10、區(qū)外的所有采樣區(qū)域,而一小分支的單倍型分布在青海的稱多種群、西藏的那曲地區(qū)南部和山南地區(qū)北部之間的高原臺(tái)面。無(wú)論是單個(gè)葉綠體單倍型分析還是兩葉綠體聯(lián)合的AMOVA分析結(jié)果都一致支持墊狀點(diǎn)地梅的遺傳變異主要存在種群間,占總遺傳變異64％以上,葉綠體rps16片段和兩基因聯(lián)合得到的NST顯著大于GST(P＜0.05),顯示墊狀點(diǎn)地梅存在顯著的譜系地理結(jié)構(gòu),但SAMOVA對(duì)所有的種群進(jìn)行分組,無(wú)論是單個(gè)葉綠體基因片段還是兩個(gè)葉綠體基因片段聯(lián)合

11、三個(gè)結(jié)果都檢測(cè)不到有意義的K值,推測(cè)因兩兩種群間的分化很大,大部分種群在擁有廣布的單倍型的同時(shí)也擁有一個(gè)或兩個(gè)以上獨(dú)特的單倍型,這樣獨(dú)特的譜系地理結(jié)構(gòu)導(dǎo)致不能有效根據(jù)地理距離分組。我們?cè)谘芯恐型茰y(cè)墊狀點(diǎn)地梅可能有多個(gè)避難所,位于藏南谷地特別是山南地區(qū)和位于青海地區(qū)稱多地區(qū);種群歷史動(dòng)態(tài)分析表明墊狀點(diǎn)地梅在末次冰期的間冰期或間冰段可能有過(guò)一次種群擴(kuò)張,并產(chǎn)生和留下了豐富的遺傳多樣性較高的單倍型,在隨后的冰期對(duì)墊狀點(diǎn)地梅存高原面上的種群可能

12、沒(méi)有影響,形成了在青藏高原地區(qū)現(xiàn)存的特有的分布格局。
　　(4)目前高山植物精細(xì)尺度的空間遺傳結(jié)構(gòu)(SGS)的研究越來(lái)越得到重視,這種空間遺傳結(jié)構(gòu)可以通過(guò)種子和花粉的分散推斷出。然而,對(duì)SGS的估計(jì)更多的取決于抽樣策略,包括抽樣的大小和空間抽樣方法。在本研究中,我們研究了抽樣大小和三種空間抽樣策略(隨機(jī)抽樣策略,樣線抽樣策略和隨機(jī)聚簇抽樣策略)對(duì)點(diǎn)地梅SGS估計(jì)的影響,點(diǎn)地梅是青藏書原特有的高山墊狀植物。使用了真實(shí)和模擬的顯性分子