基于ND4和微衛(wèi)星標(biāo)記的中國(guó)柑橘大實(shí)蠅種群遺傳結(jié)構(gòu)分析.pdf

1、柑橘大實(shí)蠅Bactrocera(Tetracus) minax(Enderlein)，又名中國(guó)果實(shí)蠅、柑蛆，是一種隸屬于雙翅目Diptera、實(shí)蠅科Tephdtida、果實(shí)蠅屬Bactrocera Macquart的檢疫性害蟲，目前已在中國(guó)、印度、不丹和尼泊爾等亞洲國(guó)家報(bào)道發(fā)生。據(jù)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，柑橘大實(shí)蠅在中國(guó)已在7省市主要發(fā)生為害，對(duì)柑橘生產(chǎn)造成了巨大的損失，故了解柑橘大實(shí)蠅的遺傳結(jié)構(gòu)，分析推測(cè)其擴(kuò)散路徑，對(duì)制定柑橘大實(shí)蠅的防控措

2、施具有重大的意義。本研究通過(guò)擴(kuò)增柑橘大實(shí)蠅1個(gè)線粒體DNA(mtDNA)基因片斷和4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)(microsatellite loci)，采用遺傳多樣性參數(shù)分析、系統(tǒng)發(fā)育樹分析和譜系生物地理學(xué)分析等方法，首次對(duì)采自中國(guó)大陸18個(gè)不同地區(qū)的柑橘大實(shí)蠅種群進(jìn)行系統(tǒng)而深入的比較研究，獲得以下主要結(jié)論:
　　1.分子標(biāo)記的確定
　　對(duì)于線粒體基因分子標(biāo)記的選定，根據(jù)前人研究，我們以柑橘大實(shí)蠅線粒體的COX1、CYTB、ND4和ND

3、5基因作為初選目標(biāo)。然后，按照A+T含量(％)、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)數(shù)、自裔位點(diǎn)數(shù)、單倍型數(shù)和核酸多樣性等6種基因多樣性指數(shù)，并結(jié)合去掉前后引物后基因片段長(zhǎng)度必須要大于500bp的原則對(duì)其進(jìn)行篩選分析，其中，四個(gè)線粒體基因片段的6種基因多樣性指數(shù)分別為:COX1,56.40、56、30、26、7、0.0092; CYTB,61.74、40、23、17、5、0.0147;ND4,65.50、64、42、22、11、0.0116; N

4、D5,66.20、36、22、14、9、0.0102。結(jié)果表明，ND4基因是這四個(gè)基因中在柑橘大實(shí)蠅上進(jìn)化率最高的線粒體基因，故選擇ND4基因片段來(lái)作為柑橘大實(shí)蠅線粒體分子標(biāo)記。
　　2.微衛(wèi)星標(biāo)記的確定
　　為了高效篩選合適的微衛(wèi)星引物進(jìn)行柑橘大實(shí)蠅遺傳結(jié)構(gòu)研究，我們首先從柑橘大實(shí)蠅同屬種柑橘小實(shí)蠅Bactrocera dorsalis、木瓜實(shí)蠅Bactrocera papayae、瓜實(shí)蠅Bactrocera cucurb

5、ita、東澳番茄實(shí)蠅Bactrocera cacuminata中挑選多態(tài)性較好的33對(duì)微衛(wèi)星引物，再對(duì)其各PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳的初篩選，及6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的再篩選，之后對(duì)其等位基因頻率、多態(tài)信息含量和有效等位基因數(shù)等指數(shù)進(jìn)行了分析。最終篩選出6對(duì)在柑橘大實(shí)蠅多態(tài)性表現(xiàn)較好的微衛(wèi)星引物，分別為位點(diǎn)Bp125(PIC=0.1546)、BcuB5.2(PIC=0.4105)、BcuF1.6(PIC=0.3086)、Bd47(

6、PIC=0.0886)、Bcac5.10(PIC=0.2745)和Bcac6.12(PIC=0.1118)。最后，根據(jù)多重PCR條件的限制（兩對(duì)目的基因片段長(zhǎng)度差異要在30bp以上，且兩對(duì)引物不能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或二聚體），選擇了其中的4對(duì)引物（Bp125、BcuF1.6、Bcac5.10和Bcac6.12）來(lái)作為柑橘大實(shí)蠅的微衛(wèi)星標(biāo)記。
　　3.柑橘大實(shí)蠅遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性
　　本實(shí)驗(yàn)共擴(kuò)增了18個(gè)柑橘大實(shí)蠅種群的359個(gè)個(gè)

7、體的ND4基因片段序列和478個(gè)個(gè)體的4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)信息，其中在ND4基因中，共發(fā)現(xiàn)了93個(gè)變異位點(diǎn)，獲得了91個(gè)單倍型;在4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上，則分別檢測(cè)到7、14、9和8個(gè)等位基因，在各個(gè)種群上則各檢測(cè)到19到30個(gè)等位基因不等，平均為23.06個(gè)等位基因。結(jié)果表明，18個(gè)柑橘大實(shí)蠅種群具有豐富的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)和單倍型，且高度的等位基因雜合性也表明柑橘大實(shí)蠅的遺傳多樣性較高。
　　柑橘大實(shí)蠅的ND4序列集和微衛(wèi)星數(shù)據(jù)集SAMOVA分析

8、結(jié)果（柑橘大實(shí)蠅種群間的遺傳變異在18個(gè)種群中所占比例較高，為38.01％）表明，柑橘大實(shí)蠅的遺傳結(jié)構(gòu)較弱。同時(shí)，18個(gè)柑橘大實(shí)蠅種群AMOVA對(duì)遺傳固定系數(shù)Fsr分析結(jié)果表明，柑橘大實(shí)蠅種群間存在明顯的遺傳分化，但微衛(wèi)星數(shù)據(jù)集的遺傳固定系數(shù)值要比ND4序列集的偏低，其原因可能是柑橘大實(shí)蠅的純合體偏多和在微衛(wèi)星位點(diǎn)上出現(xiàn)了一些無(wú)效等位基因。
　　4.柑橘大實(shí)蠅在中國(guó)大陸的擴(kuò)散中心及路徑分析
　　結(jié)合18個(gè)柑橘大實(shí)蠅種群的ND

9、4序列集和微衛(wèi)星數(shù)據(jù)集的遺傳分化系數(shù)、系統(tǒng)發(fā)育樹、基因流分析結(jié)果，我們對(duì)柑橘大實(shí)蠅在中國(guó)大陸的擴(kuò)散中心和主要擴(kuò)散路徑作出以下推斷:
　　(1)通過(guò)對(duì)比鄰近柑橘大實(shí)蠅種群間的遺傳分化系數(shù)和基因流值，尤其是重慶5個(gè)種群間，因此，我們認(rèn)為柑橘大實(shí)蠅可能具有某種“戀家”行為—即其不會(huì)主動(dòng)由其定居的山區(qū)向四周擴(kuò)散。
　　(2)對(duì)柑橘大實(shí)蠅3大組群和總體的遺傳分化系數(shù)、系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)構(gòu)和基因流值（遷入率和遷出率的不對(duì)稱性）分析發(fā)現(xiàn)，華南組

10、群處于整個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹的中部，組群的遷出率遠(yuǎn)大于其遷入率（分別為22.785和1.175），且與其他組群間的遺傳分化系數(shù)較小，因此，我們認(rèn)為華南組群應(yīng)為柑橘大實(shí)蠅在中國(guó)大陸的擴(kuò)散中心。
　　(3)同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)華中組群的十堰種群在18個(gè)柑橘大實(shí)蠅種群中處于特殊位置，十堰與其他種群的遺傳分化值相較其他種群間較小，且十堰種群的基因流也為主遷出，故我們認(rèn)為十堰應(yīng)為柑橘大實(shí)蠅在中國(guó)大陸的“橋頭堡”。
　　綜上所述，我們推測(cè)柑橘大實(shí)蠅在

11、華南開始向外擴(kuò)散，后經(jīng)華中的十堰為“中轉(zhuǎn)站”，向華中其他地區(qū)和西部地區(qū)擴(kuò)散，特別是向西南地區(qū)擴(kuò)散。
　　5.重慶柑橘大實(shí)蠅的來(lái)源地分析
　　對(duì)于柑橘大實(shí)蠅主發(fā)生地之一，我們對(duì)柑橘大實(shí)蠅在重慶的擴(kuò)散模式和種群間的遺傳關(guān)系進(jìn)行了分析。重慶5個(gè)種群（武隆、忠縣、萬(wàn)州、云陽(yáng)和巫山種群）間，幾乎沒有共享單倍型，且Structure分析結(jié)果顯示，忠縣種群應(yīng)為華南種群近幾年傳入，而武隆、萬(wàn)州和巫山這3個(gè)種群則與華中的荊州種群遺傳結(jié)構(gòu)近似，