小菜蛾酚氧化酶原編碼基因的分子克隆表達(dá)及其功能研究.pdf

1、酚氧化酶（phenoloxidase，EC.1.14.18.1，簡(jiǎn)稱PO）廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物等生物體內(nèi)，是昆蟲體內(nèi)的一種重要酶類，在昆蟲變態(tài)發(fā)育和免疫系統(tǒng)中起著重要作用，如（1）參與表皮的硬化和黑化：（2）對(duì)卵殼的鞣化作用；（3）參與傷害防御：（4）加速傷口的愈合等。本文通過RT-PCR和RACE技術(shù)，克隆得到了編碼小菜蛾（Plutella xylostella）酚氧化酶原的兩個(gè)基因Prophenoloxidase1（PxPP

2、O1）和Prophenoloxidase2（PxPPO2）：并通過Semi-Quantitative RT-PCR和Quantitative Real-timePCR研究了PPO1和PPO2在小菜蛾不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況；同時(shí)使用兩種典型的PO抑制劑-槲皮素和曲酸，對(duì)小菜蛾3齡幼蟲進(jìn)行了點(diǎn)滴處理，測(cè)定了處理后24h、48h和72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)PPO2的表達(dá)情況。研究結(jié)果如下：
　　 1.PxPPO1全長(zhǎng)cDNA序列有2838 bp

3、，包含一個(gè)2049 bp的開放閱讀框（ORF），一個(gè)144 bp的5’非編碼區(qū)（5’UTR）和一個(gè)645 bp的帶有加尾信號(hào)的3'非編碼區(qū)（3’UTR）。開放閱讀框從第145個(gè)核苷酸開始，終止于第2193個(gè)核苷酸，由其推導(dǎo)的氨基酸序列以甲硫氨酸為起始氨基酸，長(zhǎng)為682個(gè)氨基酸，分子量為78.56 kDa，估測(cè)等電點(diǎn)pI為6.43。PxPPO1的半衰期為30h，不穩(wěn)定系數(shù)為42.01，化學(xué)分子式為C3468H5320N1000O1020S

4、38。
　　 2.PxPPO2全長(zhǎng)cDNA序列有2546 bp，包含一個(gè)2091 bp的開放閱讀框（ORF），一個(gè)80 bp的5’非編碼區(qū)（5’UTR）和一個(gè)375 bp的帶有加尾信號(hào)的3’非編碼區(qū)（3’UTR）。開放閱讀框從第81個(gè)核苷酸開始，終止于第2171個(gè)核苷酸，由其推導(dǎo)的氨基酸序列也以甲硫氨酸為起始氨基酸，長(zhǎng)為696個(gè)氨基酸。PxPP02的分子量為79.86 kDa，估測(cè)等電點(diǎn)pI為6.44。PXPPO的體外半衰期為3

5、0h，不穩(wěn)定系數(shù)為47.12，化學(xué)分子式為C3552H5459N1013O1046S24。
　　 3.氨基酸序列比對(duì)分析結(jié)果表明，PxPPO1基因的氨基酸序列與其它鱗翅目昆蟲PPO1基因具有較高的同源性（70.5％～74.6％）：PxPPO2基因的氨基酸序列與其它鱗翅目昆蟲PPO2基因也具有較高的同源性（72.2％～78.3％）。
　　 4.PxPPO1和PxPPO2各均具有兩個(gè)高度保守的銅離子結(jié)合位點(diǎn)，及位于銅離子結(jié)合

6、位點(diǎn)內(nèi)的6個(gè)保守的組氨酸殘基，此外，還包含一個(gè)類似于脊椎動(dòng)物的α-巨球蛋白的硫羥酸酯區(qū)域。PxPPO1與PxPPO2的N端均不含信號(hào)肽，不存在跨膜結(jié)構(gòu)域。
　　 5.PxPPO1中，α-螺旋占25.37％，隨機(jī)卷曲占55.87％，它們是PxPPO1最大量的結(jié)構(gòu)元件，延伸鏈占18.77％，散布在整個(gè)蛋白質(zhì)中，無β轉(zhuǎn)角存在；PxPPO2中，α-螺旋占24.57％，隨機(jī)卷曲占58.91％，同樣是最大量的結(jié)構(gòu)元件，而延伸鏈占16.52％

7、，散布在整個(gè)蛋白質(zhì)中，無β轉(zhuǎn)角存在。同源建模顯示二者三級(jí)結(jié)構(gòu)均為“α/β型”中的“滾筒結(jié)構(gòu)”。
　　 6.PxPPO1在成蟲中的表達(dá)量最低，設(shè)定為1.0，其在卵和4齡幼蟲中表達(dá)量最高，分別為21.78和19.51：在1齡幼蟲中表達(dá)量為6.44；在2齡、3齡和蛹中分別為15.76、14.09和16.88，較為接近。PxPPO2在成蟲中的表達(dá)量較低，設(shè)定為1.0，其在卵和4齡幼蟲中表達(dá)量最高，分別為22.34.和19.20；在1齡幼