羅氏沼蝦Nodavirus的分離、致病性與檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、羅氏沼蝦(Macrobraehium rosenbergii)又名馬來西亞大蝦，我國(guó)淡水甲殼類的主要養(yǎng)殖品種。我國(guó)羅氏沼蝦的養(yǎng)殖面積達(dá)50萬畝以上，總產(chǎn)量超過10萬噸，已成為全球羅氏沼蝦養(yǎng)殖大國(guó)。羅氏沼蝦肌肉白濁病是近年來發(fā)生在我國(guó)羅氏沼蝦主要產(chǎn)區(qū)的一種新型疾病，又稱為羅氏沼蝦白體病或羅氏沼蝦白尾病，主要危害羅氏沼蝦淡化苗，病蝦表現(xiàn)為肌肉出現(xiàn)白斑、白濁或全身發(fā)白，病蝦可在幾天內(nèi)死亡，死亡率最高達(dá)40％～90％。該病于1994年后在我國(guó)廣

2、東省發(fā)現(xiàn)，2000年浙江、江蘇、上海、廣東、廣西等地出現(xiàn)較大規(guī)模的流行，給許多養(yǎng)殖場(chǎng)及育苗場(chǎng)造成了巨大的損失。 作者對(duì)浙江省某羅氏沼蝦苗種場(chǎng)發(fā)生典型肌肉白濁病的蝦苗進(jìn)行了病原研究，通過細(xì)菌分離、除菌組織懸液制備及人工感染試驗(yàn)、超薄切片、病毒粗提取，結(jié)果表明：從白濁病病蝦的肌肉、肝胰腺中分離到的細(xì)菌以5×10<'8>CFU/ml濃度浸泡感染正常沼蝦苗不能復(fù)制疾??；病蝦除菌組織過濾液以1∶50、1∶250濃度浸泡感染正常蝦苗，7天后

3、可發(fā)病，并出現(xiàn)典型的肌肉白濁病癥狀，氯仿處理不能破壞病毒的感染力；通過病蝦超薄切片電鏡觀察發(fā)現(xiàn)肌肉間隙組織中存在23-25nm大小的球狀病毒。病蝦組織漿經(jīng)氯仿處理、PEG沉淀、磷鎢酸負(fù)染后可見到大量22nm大小的球狀病毒顆粒，無囊膜。 采用Trizol試劑進(jìn)行了病毒的核酸提取，電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)2個(gè)核酸片段，分別為3.0Kb、1.3Kb，病毒核酸對(duì)RNA核酸酶、S1核酸酶敏感，對(duì)DNA酶抵抗，為單鏈RNA病毒，符合諾達(dá)病毒的特性。用羅

4、氏沼蝦諾達(dá)病毒核酸探針進(jìn)行分子雜交，探針可與提純核酸及病蝦樣品勻漿液反應(yīng)，Sounthern雜交表明3.0Kb、1.3Kb條帶分別屬于諾達(dá)病毒的RNA1和RNA2，表明我國(guó)發(fā)現(xiàn)的諾達(dá)病毒與法屬瓜德羅普島的諾達(dá)病毒存在較大同源性。該病毒命名為羅氏沼蝦諾達(dá)病毒fMaerobraehium rosenbergiinodavirus，MrNV)。 用PEG沉淀結(jié)合超速離心，提純了MrNV。用純化MrNv免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾細(xì)胞

5、與SP2/0鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，研制了抗MrNV的鼠單克隆抗體。用純化MrNV包板間接ELISA篩選陽性融合孔，經(jīng)有限稀釋法克隆，共得到12株能特異分泌抗MrNV的單克隆抗體(Mab)的雜交瘤細(xì)胞。注射小鼠，制備腹水單克隆抗體，ELISA效價(jià)為1∶10<'5>～10<'6>。亞型鑒定結(jié)果表明，有6株單抗為IgG1型，4株單抗為IgG2a型，2株單抗為IgG2b型。12株單抗與WSSV和TSV均無交叉反應(yīng)。對(duì)所獲得的單克隆抗體進(jìn)行了Wesr

6、ern bolt分析，表明所獲單抗可與羅氏沼蝦諾達(dá)病毒43kD的主要外膜蛋白特異性結(jié)合。 采用提純病毒制備了羅氏沼蝦諾達(dá)病毒兔抗血清，通過兔抗血清及羅氏沼蝦諾達(dá)病毒單克隆抗體285，建立了三抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法(TAS-ELISA)，研究了TAS-ELISA最適反應(yīng)條件為：兔抗體以1μg/ml包板，小鼠單抗285工作濃度1：50，000。該法檢測(cè)MrNV的靈敏度達(dá)0.98ng，對(duì)WSSV、TSV及其它細(xì)菌感染死亡的羅氏沼蝦苗

7、沒有非特異性反應(yīng)。通過對(duì)2000-2002年病蝦及疑似病蝦的病毒檢測(cè)，表明TAS-ELISA法比間接ELISA法和核酸電泳法有更高的陽性檢出率和符合率：降低測(cè)定孵育溫度和縮短孵育時(shí)間對(duì)病毒檢測(cè)無明顯影響，使得本法更加適合于生產(chǎn)實(shí)踐。 采用羅氏沼蝦肌肉白濁病典型病蝦苗制備病毒懸液，對(duì)羅氏沼蝦苗種進(jìn)行了人工感染試驗(yàn)。結(jié)果表明：羅氏沼蝦諾達(dá)病毒對(duì)健康羅氏沼蝦苗種有極強(qiáng)的致病力，發(fā)病高峰出現(xiàn)在病毒感染后9-12天；病毒懸液以1∶6250

8、0稀釋仍可使蝦苗發(fā)病，最低感染劑量相當(dāng)于0.6ng;不同的養(yǎng)殖環(huán)境對(duì)于病毒感染的發(fā)病過程與死亡率有極強(qiáng)的相關(guān)性，在光照條件下，發(fā)病死亡率可大大降低；緬甸原種與本地種群均表現(xiàn)出的羅氏沼蝦諾達(dá)病毒的敏感性，但緬甸原種死亡率略低于本地種群，且發(fā)病過程也相對(duì)較長(zhǎng)，表現(xiàn)為一定的病毒抵抗力。通過免疫酶技術(shù)分析了病毒的組織嗜性，發(fā)現(xiàn)諾達(dá)病毒有較強(qiáng)的肌肉組織嗜性，主要分布在肌肉組織中，肝胰腺等組織中未發(fā)現(xiàn)病毒感染，這與羅氏沼蝦肌肉白濁病的發(fā)病癥狀相一致