患病羅氏沼蝦幼體可疑病原核酸隨機克隆技術(shù)的探索.pdf

1、羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii),屬長臂蝦科(Palaemonidae)、沼蝦屬(Macrobrachium),亦稱白腳蝦、馬來西亞大蝦、金錢蝦、萬氏對蝦等,原產(chǎn)于印度太平洋地區(qū),生活在各種類型的淡水或咸淡水水域,1976年由日本引進我國,是目前世界上養(yǎng)殖量最高的三大蝦種之一,也是我國淡水甲殼類的主要養(yǎng)殖品種。但近些年,隨著羅氏沼蝦養(yǎng)殖面積的持續(xù)擴大,集約化程度的不斷提高,病毒病也隨之頻發(fā),給羅氏沼蝦養(yǎng)殖帶

2、來了極大的威脅。到目前為止,報道過的感染羅氏沼蝦的病毒有四種即白斑綜合征病毒(WSSV),羅氏沼蝦野田村病毒(Macrobrachium Rosenbergii Nodavirus,MrNV),可能作為 MrNV衛(wèi)星病毒或輔助病毒的極小病毒(extra small virus-like particles，XSV),以及一種比較罕見的能感染羅氏沼蝦肝胰腺上皮細胞的細小病毒樣病毒(parvo-like virus)。
　　2011年

3、3月于浙江某羅氏沼蝦育苗場采集了一批患病的羅氏沼蝦幼體樣本,經(jīng)勻漿、0.45微米濾膜過濾、差速離心、DNase I和RNase A處理,再提取可疑病毒核酸,用多重隨機 PCR和序列非依賴的單引物擴增(Sequence independent single primer amplification，SISPA)兩種隨機克隆技術(shù)分別對采集的患病幼體樣本進行DNA和RNA的隨即克隆和測序,用BLASTn進行測序結(jié)果分析,特異性檢測可疑序列。<

4、br>　　通過多重隨機 PCR技術(shù)對可疑 DNA病毒進行分析,共得到了22個測序結(jié)果,使用NCBI中的BLASTn在 NR庫中進行比對,其中14個克隆為載體,1個克隆測序結(jié)果無意義,2個克隆為細菌,3個克隆為羅氏沼蝦基因組序列,2個可疑的低同源性序列,序列最短為45bp,最長為1135bp,平均長度為873bp。2個可疑病毒序列分別長597bp和1053bp。
　　通過序列非依賴的單引物擴增(SISPA)技術(shù)對可疑 RNA病毒進行

5、分析,共得到48個可疑 RNA提取物來源的克隆的插入片段的測序,測序得到的序列使用NCBI中的blastn功能,在 NR庫中進行比對,其中7個克隆為載體,17個克隆結(jié)果無意義,10個克隆為細菌.5個克隆為羅氏沼蝦基因組序列或線粒體基因序列,2個克隆為病毒序列,7個為低同源性序列。測得的序列長度最短為71bp,最長為1167bp,平均長度為389bp。在測序得到的兩段與病毒具有部分同源序列的克隆插入片段序列中,一段長551bp的克隆插入片

6、段與西番蓮屬萎黃病毒(Passiflora chlorosis virus,PCV)序列有一定同源性,一段長441bp的克隆插入片段與輪狀病毒(Rotavirus,RV)序列有一定同源性。根據(jù)這兩段克隆插入片段序列設計引物對樣品進行特異性鑒定的結(jié)果顯示這些克隆插入片段序列確實是來源于采集的羅氏沼蝦幼體樣本。
　　本文使用多重隨機 PCR技術(shù)和序列非依賴的單引物擴增技術(shù),對羅氏沼蝦幼體樣本進行分析的結(jié)果說明,可以應用這兩種隨機克隆技