抗病轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)育明恢63后代抗性純合系的篩選及其遺傳穩(wěn)定性研究.pdf

1、稻瘟病是水稻稻作區(qū)一種嚴(yán)重的真菌性病害。培育抗病品種是解決這一病害最有效的途徑，通過(guò)生物技術(shù)手段與常規(guī)選育相結(jié)合創(chuàng)制抗病新種質(zhì)預(yù)示了良好的應(yīng)用前景。本研究以攜帶外源溶菌酶基因的ZH9(R)(高抗稻瘟病)為抗源供體，以?xún)?yōu)良的超級(jí)雜交稻恢復(fù)系明恢63(MH63)為受體，通過(guò)對(duì)MH63回交轉(zhuǎn)育轉(zhuǎn)移溶菌酶基因，獲得抗性改良的新恢復(fù)系。作者在獲得回交2-4代材料的基礎(chǔ)上，通過(guò)抗生素輔助篩選體系進(jìn)一步鑒定出轉(zhuǎn)基因純合系；對(duì)轉(zhuǎn)育后代目的基因的追蹤及抗

2、病性鑒定、抗性純合系的人工接種鑒定，分析外源基因的遺傳規(guī)律、轉(zhuǎn)育材料的抗性表現(xiàn)及稻瘟病抗性的遺傳穩(wěn)定性；對(duì)轉(zhuǎn)育后代主要農(nóng)藝性狀的考察，分析轉(zhuǎn)育后代農(nóng)藝性狀的遺傳穩(wěn)定性，并通過(guò)定向選擇篩選出綜合性狀優(yōu)良的抗病株系。 1.明恢63轉(zhuǎn)育后代中抗性純合系的篩選 在本課題組先前建立的轉(zhuǎn)基因水稻快速檢測(cè)技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過(guò)G418對(duì)抗生素標(biāo)記基因的輔助篩選(種子篩選和葉片篩選)，從轉(zhuǎn)育后代中快速鑒定出外源溶菌酶基因純合的轉(zhuǎn)育株系。

3、 研究發(fā)現(xiàn)，在一定濃度的G418脅迫條件下，轉(zhuǎn)育株系各器官、組織對(duì)抗生素具有不同的抗感反應(yīng)。在種子篩選中，根據(jù)G418對(duì)水稻種子發(fā)芽特性(發(fā)芽率、生根率、根伸長(zhǎng)受阻等抑制效應(yīng))篩選出高抗抗生素類(lèi)株系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TD-3、TD-10、TD-18三個(gè)株系發(fā)芽率、生根率、長(zhǎng)根類(lèi)種子比率都達(dá)90％左右，死亡率在10％以下，說(shuō)明群體受抗生素毒害小，推測(cè)此株系為npt-Ⅱ基因純合系，繼續(xù)選其葉片做抗生素篩選試驗(yàn)及分子檢測(cè)。 隨后對(duì)這些材

4、料做抗生素脅迫下的離體葉片鑒定，經(jīng)χ2檢測(cè)陽(yáng)性株與陰性株分離比為1∶0；PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)同一株系內(nèi)各單株不發(fā)生分離，因此這三個(gè)株系最終被確認(rèn)為npt-Ⅱ基因、溶菌酶基因純合系。 通過(guò)對(duì)回交轉(zhuǎn)育后代株系的離體葉片篩選，共獲得19個(gè)抗性純系，其中BC4F3代3個(gè)，BC3F4代10個(gè)、BC2F5代6個(gè)。 2.明恢63轉(zhuǎn)育后代抗稻瘟病遺傳穩(wěn)定性研究 通過(guò)各轉(zhuǎn)育世代部分株系的外源基因檢測(cè)，轉(zhuǎn)育后代稻瘟病抗性的大田鑒

5、定及抗性純合系的人工接種鑒定，分析溶菌酶基因的遺傳規(guī)律、轉(zhuǎn)育后代的抗性表現(xiàn)及抗性遺傳穩(wěn)定性，并評(píng)價(jià)溶菌酶基因的抗性效果。得出如下結(jié)論： 1)對(duì)由同一系譜來(lái)的分屬于BC4F1、BC4F2、BC4F3代3個(gè)株系做葉片抗生素檢測(cè)，經(jīng)遺傳分析，得出外源基因?yàn)閱位蝻@性遺傳，符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律。對(duì)純合系TD-10與不育系測(cè)交后代進(jìn)行溶菌酶基因分子檢測(cè)，結(jié)果都擴(kuò)增出了特異性條帶，由此說(shuō)明外源基因能在轉(zhuǎn)育后代中穩(wěn)定傳遞，且能通過(guò)雜交穩(wěn)定遺傳給

6、下一代。 2)從兩年的病圃抗性鑒定情況看，轉(zhuǎn)育后代對(duì)稻瘟病抗性明顯好于MH63。2004年各世代葉瘟病情指數(shù)比MH63降低11％，穗頸瘟病情指數(shù)比MH63降低14％；2005年葉瘟病情指數(shù)比MH63降低2％，穗頸瘟降低13％。在世代間的比較中2004年以回交高世代抗性好于低世代，而2005年這種差異不顯著：2004年葉瘟抗性BC4F1病情指數(shù)比BC3F2、BC2F3分別下降6.62％、11.63％，穗頸瘟抗性BC4F1病情指數(shù)比

7、BC3F2、BC2F3分別下降4.18％和2.39％；2005年各世代葉瘟抗性差異不顯著，都為25％左右，穗頸瘟BC4F3代病情指數(shù)比BC2F5僅下降1.34％。 3)分析了各世代抗性株系穗頸瘟抗性指標(biāo)和變異系數(shù)，各世代株系間病情指數(shù)波動(dòng)不大，損失指數(shù)、病情指數(shù)變異系數(shù)普遍較低，分別在0.04和0.07以下，說(shuō)明抗性純合系抗性較穩(wěn)定。 4)葉瘟和穗頸瘟病情指數(shù)相關(guān)系數(shù)都超過(guò)了0.5，說(shuō)明二者有一定的正相關(guān)性，BC3F4代

8、相關(guān)性較大，接近0.7，BC4F3次之，為0.5772，BC2F5為0.5536。 5)人工接種76個(gè)菌株發(fā)現(xiàn)，BC4F3代純合株系TD-10對(duì)8個(gè)菌株感病，其抗性頻率為89.47％，TD-3、TD-18分別對(duì)7個(gè)、6個(gè)菌株感病，其抗性頻率都超過(guò)了90％，屬高抗(HR)水平；而輪回親本明恢63對(duì)其中21個(gè)菌株感病，其抗性頻率為72.37％，屬中抗(MR)水平。轉(zhuǎn)育材料較明恢63抗譜增加18.42％，與溶菌酶基因?qū)λ腩i瘟抗性貢獻(xiàn)率

9、估計(jì)值(15％-21％)較為一致，這充分說(shuō)明了溶菌酶基因?qū)Φ疚敛【哂休^強(qiáng)的廣譜抗性，通過(guò)轉(zhuǎn)育能顯著提高其親本抗性。 3.明恢63轉(zhuǎn)育后代農(nóng)藝性狀遺傳穩(wěn)定性研究 通過(guò)農(nóng)藝性狀考察，分析各轉(zhuǎn)育后代回復(fù)效果，并分析各回交自交后代農(nóng)藝性狀的遺傳穩(wěn)定性，通過(guò)定向選擇，選育出具有優(yōu)良變異特性的新種質(zhì)。 1)通過(guò)株高、穗長(zhǎng)、結(jié)實(shí)率、千粒重、單株產(chǎn)量5個(gè)主要農(nóng)藝性狀考察，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)育后代隨著回交次數(shù)增加，與明恢63的差異逐漸縮小，

10、株高在回交2次后與明恢63僅相差0.6cm、穗長(zhǎng)回交2次后超過(guò)親本0.55cm，結(jié)實(shí)率在回交3次后超過(guò)親本1.97％，千粒重、單株產(chǎn)量在回交3次后分別超過(guò)親本0.14g、1.72g。這說(shuō)明通過(guò)適當(dāng)?shù)幕亟煌耆梢砸胗H本的優(yōu)良特性。 2)同一回交代隨著自交代的增加，各農(nóng)藝性狀變異系數(shù)降低，在自交3代后，變異系數(shù)穩(wěn)定且趨向于0，說(shuō)明這些農(nóng)藝性狀隨著自交世代增加會(huì)越趨穩(wěn)定。 3)在選擇時(shí)入選親本特性的基礎(chǔ)上還兼顧其他優(yōu)良性狀，