甘藍(lán)型油菜抗病蟲(chóng)基因遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株抗性鑒定的研究.pdf

1、油菜是世界上最重要的油料作物之一，病蟲(chóng)害的嚴(yán)重影響對(duì)油菜產(chǎn)量的提高是一個(gè)較大的制約因素，因此油菜抗病蟲(chóng)研究一直是廣大研究者的育種目標(biāo)之一，然而油菜抗性種質(zhì)資源的匱乏是制約育種進(jìn)程的重要因素。隨著植物基因工程技術(shù)的發(fā)展和成熟，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化將外源抗病蟲(chóng)基因?qū)氲皆耘喾N中，然后對(duì)轉(zhuǎn)化后代進(jìn)行農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀的定向選擇，能夠獲得高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的抗病蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因育種材料，從而擴(kuò)大油菜抗病蟲(chóng)育種的種質(zhì)資源。農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在油菜轉(zhuǎn)基因研究中已被廣泛

2、應(yīng)用，然而油菜的遺傳轉(zhuǎn)化效率受多種因素的影響，因此建立一套高效的遺傳轉(zhuǎn)化再生體系是油菜轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功的關(guān)鍵。本研究以甘藍(lán)型油菜品種子葉柄為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)油菜遺傳轉(zhuǎn)化再生體系的影響因素進(jìn)行了分析，并且通過(guò)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)和抗病蟲(chóng)效果評(píng)價(jià)對(duì)外源目的基因的遺傳分離規(guī)律和表達(dá)情況進(jìn)行了分析，取得的主要研究結(jié)果如下：
　　 1.甘藍(lán)型油菜浙雙758子葉柄再生體系的建立。研究外源激素的濃度及配比組合、硝酸銀和蔗糖濃度等因素對(duì)子葉柄外植體再生

3、頻率的影響。結(jié)果表明，不同濃度2，4-D對(duì)子葉柄外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率及產(chǎn)生愈傷組織的質(zhì)量有影響，最適濃度為2.0 mg/L，愈傷誘導(dǎo)率達(dá)到89.6％，2，4-D濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生的愈傷組織畸形，影響再生芽分化率。愈傷組織分化階段，同時(shí)添加3.0 mg/L6-BA+0.1 mg/L NAA的分化培養(yǎng)基，愈傷組織芽再生頻率最高(為53.4％)，優(yōu)于其它配比組合。添加2.5 mg/L AgNO3不僅能降低愈傷組織褐化現(xiàn)象，同時(shí)能提高愈傷組織

4、芽分化頻率，以3.0 mg/L6-BA+0.1 mg/L NAA+2.5 mg/L AgNO3的分化培養(yǎng)基芽再生頻率最高(達(dá)到86.7％)。子葉柄外植體愈傷組織分化出的再生苗存在一定程度玻璃化現(xiàn)象，10 mg/L的蔗糖濃度能維持再生苗的生長(zhǎng)，同時(shí)能顯著改善玻璃化的現(xiàn)象。激素的使用對(duì)于再生植株的生根有明顯的促進(jìn)作用，在生根培養(yǎng)基中添加4.0 mg/L IAA，生根率達(dá)到91.1％。
　　 2.甘藍(lán)型油菜浙雙758子葉柄外植體農(nóng)桿菌

5、介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立。研究農(nóng)桿菌侵染濃度、乙酰丁香酮、抑菌素濃度和抗生素篩選濃度等對(duì)根癌農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化效率和轉(zhuǎn)化植株再生的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加乙酰丁香酮對(duì)子葉柄外植體膨大率并無(wú)影響，農(nóng)桿菌侵染濃度過(guò)高則容易導(dǎo)致子葉柄外植體受農(nóng)桿菌的影響而出現(xiàn)腐爛壞死現(xiàn)象，方差分析表明兩者對(duì)子葉柄外植體膨大的影響不存在互作效應(yīng)。羧芐青霉素對(duì)農(nóng)桿菌的抑制效果以500 mg/L的濃度最好，且對(duì)子葉柄外植體愈傷組織誘導(dǎo)和分化的影響最小，愈傷組織誘導(dǎo)率和芽再生

6、率分別為75.2％和65.1％。在生根培養(yǎng)階段以添加100 mg/L頭孢霉素能有效抑制農(nóng)桿菌對(duì)再生苗的影響，且不會(huì)對(duì)再生植株的生根產(chǎn)生影響。5.0 mg/L的潮霉素能完全抑制未轉(zhuǎn)化再生植株的生長(zhǎng)，使其最終褐化死亡，在此潮霉素篩選濃度下，我們獲得了32株轉(zhuǎn)化再生植株。共培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基中添加100μmol/L AS的芽再生頻率為3.9％，顯著高于未添加AS的芽再生頻率(2.0％)，說(shuō)明在子葉柄外植體轉(zhuǎn)化體系中，共培養(yǎng)階段添加酚類(lèi)物質(zhì)乙酰丁香酮

7、有利于轉(zhuǎn)化載體T-DNA的轉(zhuǎn)化。
　　 3.轉(zhuǎn)化再生植株的分子生物學(xué)檢測(cè)及抗病蟲(chóng)效果的鑒定。經(jīng)PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中27株T0代轉(zhuǎn)化再生植株能擴(kuò)增得到兩個(gè)外源目的基因，遺傳轉(zhuǎn)化率為4.5％。隨機(jī)選取8株材料進(jìn)行Southern雜交鑒定，其中4株為單拷貝(T0-11、T0-14、T0-16、T0-26)，其余為多拷貝，Northern雜交檢測(cè)表明蛋白質(zhì)酶抑制基因在轉(zhuǎn)化植株中經(jīng)受傷誘導(dǎo)能高效穩(wěn)定表達(dá)。對(duì)上述8株轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行生物學(xué)離體

8、抗病蟲(chóng)接種試驗(yàn)，轉(zhuǎn)化植株葉片上接種的小菜蛾4天后平均重量為11.1-19.2mg，存活率僅為5-25％，顯著低于對(duì)照材料的平均重量(40.3 mg)和存活率(100％)。菌核病菌接種2天后，轉(zhuǎn)化植株能顯著抑制病菌的生長(zhǎng)，病斑直徑平均值為0.73-2.17 cm，顯著小于對(duì)照材料(2.87 cm)。以上結(jié)果說(shuō)明通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化蛋白質(zhì)酶抑制基因和幾丁質(zhì)酶基因的再生植株對(duì)油菜病蟲(chóng)害有一定的抗性。
　　 4.T1代植株外源目的基因的遺傳分

9、離規(guī)律和抗病蟲(chóng)效果鑒定。對(duì)4株T0代單拷貝轉(zhuǎn)化再生植株(T0-11、T0-14，T0-16、T0-26)的子代進(jìn)行PCR檢測(cè)，陽(yáng)性植株與陰性植株的比例為3:1，經(jīng)卡平方測(cè)驗(yàn)表明外源目的基因分離比符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，同時(shí)也證明4株T0代轉(zhuǎn)化植株外源目的基因的整合方式為單拷貝。RT-PCR和Northern雜交檢測(cè)表明外源目的基因在T1-11陽(yáng)性植株中經(jīng)受傷誘導(dǎo)均能高效穩(wěn)定表達(dá)，且植株之間表達(dá)量無(wú)明顯差異。對(duì)T1-11的10株陽(yáng)性植株進(jìn)行生

10、物學(xué)離體抗病蟲(chóng)接種試驗(yàn)，陽(yáng)性植株對(duì)病蟲(chóng)害的抗性效果與其親本相當(dāng)，小菜蛾接種4天后的平均重量為19.6-25.3 mg，存活率為20-40％，顯著低于對(duì)照材料的平均重量(47.3 mg)和存活率(100％)。菌核菌接種2天后，T1-11的10株陽(yáng)性植株葉片病斑直徑平均值為1.03-1.93 cm，顯著小于對(duì)照材料(3.17cm)，病斑直徑平均值平均值為1.57 cm，與親本材料T0-11的抗性相當(dāng)(1.17 cm)。以上結(jié)果表明外源目的基