裸甲藻溶藻細(xì)菌的篩選及其胞外抑藻活性物質(zhì)的分離鑒定.pdf

1、在適宜的條件下，一些藻類能夠急劇增加或聚集，海水中藻細(xì)胞密度銳增，使水體顏色改變，并有可能造成海洋生物死亡，這就是所謂的赤潮(redtide)現(xiàn)象。除了微藻外，其他一些單細(xì)胞浮游生物也能夠形成赤潮。
　　海洋水體富營養(yǎng)化是導(dǎo)致赤潮的直接原因。國內(nèi)外對赤潮的研究已持續(xù)幾十年，前人在采用物理、化學(xué)和其他生物學(xué)方法治理赤潮不甚理想的狀況下，利用微生物進(jìn)行生物控藻引起了人們的極大關(guān)注
　　目前，溶藻微生物主要包括:溶藻細(xì)菌、溶藻放線

2、菌、溶藻真菌、噬藻體、原生動(dòng)物。是最具潛力的生物控制方法之一。
　　溶藻細(xì)菌(Algicidalbacteria)是指以直接或間接方式抑制或殺死藻類、溶解藻細(xì)胞的細(xì)菌統(tǒng)稱。1924年溶藻細(xì)菌首次被發(fā)現(xiàn)。
　　微藻中的裸甲藻，是南方海域赤潮爆發(fā)多見報(bào)道的一種優(yōu)勢藻種。
　　裸甲藻屬甲藻門，是單細(xì)胞微藻，是水生動(dòng)物的餌料，大量繁殖使水體在陽光的照射下反映出紅棕色，但過量生長則形成對水產(chǎn)有害的“赤潮”。而且能夠產(chǎn)生多種毒素，

3、使魚蝦貝類死亡等，對人體亦有危害。國內(nèi)外對裸甲藻引起的赤潮研究相對較少。
　　本研究依次從中國萊州灣、膠州灣以及海南三亞市紅沙港等海域采集水樣，采用液體感染法，即將劃線分離的單菌落菌液與裸甲藻培養(yǎng)物共培養(yǎng)，最終從海南三亞市紅沙港海域分離到兩株對裸甲藻(Gymnodiniumsp.)有明顯抑制效果的海洋細(xì)菌HSB01和HSB07。且細(xì)菌HSB07比HSB07抑藻效果更強(qiáng)。
　　通過對兩株菌的形態(tài)觀察、分子和生理生化特征鑒定，得

4、出HSB01是葡萄球菌屬，HSB07是鹽單胞菌屬。
　　通過發(fā)酵兩株菌并分離細(xì)菌菌體與胞外代謝物，然后分別與裸甲藻共培養(yǎng)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)HSB07用乙酸乙酯萃取的發(fā)酵物粗提物表現(xiàn)出相對明顯的抑藻作用。
　　對細(xì)菌HSB07進(jìn)行20LLB海水培養(yǎng)基規(guī)模發(fā)酵，得到14g粗提物。經(jīng)硅膠柱層析、薄層層析得到兩個(gè)組分B和C。
　　將適量組分B和C以DMSO（二甲基亞砜）溶解，同樣采用液體感染法，即將DMSO溶解的組分B和C分別與裸甲藻

5、培養(yǎng)物共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)組分B具有顯著的抑藻作用，組分C亦具有一定的抑藻作用。
　　組分B和C進(jìn)一步進(jìn)行凝膠柱層析、液相分析與分離，從組分C分離得到一個(gè)純組分，即為組分＃12。對組分＃12采用核磁共振和質(zhì)譜分析鑒定，確定其分子量為414。具體結(jié)構(gòu)還需進(jìn)一步分析鑒定。
　　鑒于20L規(guī)模發(fā)酵得到的生物量不夠理想，因而對細(xì)菌HSB07的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。參考20L規(guī)模發(fā)酵條件28℃、pH7.5、鹽度為3、發(fā)酵時(shí)間24～48h。以發(fā)酵

6、液的pH、鹽度和發(fā)酵時(shí)間三個(gè)因素作為影響胞外活性物質(zhì)含量的主要參數(shù)。各因素選取3個(gè)水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，選用L9(34)正交表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。將發(fā)酵好的細(xì)菌發(fā)酵液高速離心（6500rpm）10min，分離得到上層細(xì)菌胞外代謝物和下層菌體，收集上層液。向120ml藻培物中加入15ml細(xì)菌胞外代謝物與藻共培養(yǎng)，以溶藻率作為評價(jià)發(fā)酵條件的指標(biāo)。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.裸甲藻溶藻菌的篩選、鑒定
　　1)從海南三亞紅沙崗水樣中共分離出7株細(xì)

7、菌，其中2株細(xì)菌表現(xiàn)出明顯的抑藻作用，分別標(biāo)記為HSB01、HSB07。抑藻試驗(yàn)再驗(yàn)證并進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)得知:細(xì)菌HSB01和HSB07均具有較強(qiáng)的抑藻作用，且細(xì)菌HSB07比HSB01抑藻作用更強(qiáng)。
　　2)對2株溶藻細(xì)菌進(jìn)行分子鑒定:16SrDNA測序，與Genbank中已知序列BLAST，結(jié)合生理生化特征分析，結(jié)果表明:細(xì)菌HSB01、HSB07分別屬于葡萄球菌屬（Staphylococcussp.）、鹽單胞菌屬（Halo

8、monassp.）;Genbank號分別為KC832320、KC832321。
　　3)對2株溶藻細(xì)菌的菌落進(jìn)行形態(tài)觀察:細(xì)菌HSB01呈淺黃色，菌落小而圓，表面凸起，粉質(zhì)，邊緣光滑;細(xì)菌HSB07透明，菌落較大而圓，濕潤黏粘而不易被挑起，邊緣不太光滑。電鏡觀察可知兩株菌均無鞭毛。
　　2.裸甲藻溶藻菌的抑藻特性
　　1)在裸甲藻生長的第14天，即藻對數(shù)生長期末期，分別加入兩株菌液，經(jīng)差異顯著性檢驗(yàn)得出:加入HSB07

9、菌液的藻培物一開始即與自然生長的藻培物藻密度存在顯著差異，Sig值小于0.05;而加入HSB01菌液的藻培物一開始與自然生長的藻培物藻密度差異不顯著，Sig值為0.27＞0.05，在接下來共培養(yǎng)期間，才表現(xiàn)出顯著差異。這表明兩株菌HSB01、HSB07都能明顯地抑制裸甲藻的生長。在藻對數(shù)生長期末期分別加入兩菌培養(yǎng)液，都能加速藻由對數(shù)生長末期進(jìn)入衰退期，且HSB07作用更明顯。
　　2)對細(xì)菌HSB01、HSB07的抑藻特性進(jìn)行研究

10、，發(fā)現(xiàn)這兩株菌的抑藻因子均不是細(xì)菌菌體，而是分泌的次級代謝產(chǎn)物，即間接抑藻。
　　3.裸甲藻溶藻菌中活性物質(zhì)的分離提純
　　1)通過對HSB07大量發(fā)酵、乙酸乙酯萃取粗提物進(jìn)行抑藻試驗(yàn)表明:該粗提物具有較好抑藻活性。
　　2)經(jīng)過硅膠柱層析和薄層層析，得到兩個(gè)組分B和C。
　　3)將組分B和C分別與裸甲藻培養(yǎng)物共培養(yǎng)進(jìn)行抑藻試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)組分B具有顯著的抑藻作用，組分C亦具有一定的抑藻作用
　　4)對組分B和C