轉(zhuǎn)基因番茄的可見-近紅外光譜快速無損檢測方法.pdf

1、生物技術(shù)的快速發(fā)展，特別是基因工程技術(shù)的發(fā)展使得人類可以將外源基因插到受體物種的基因組中，從而使物種產(chǎn)生抗逆性、抗蟲性及其它新的特性，這影響著人類生活的方方面面，包括農(nóng)業(yè)、家禽業(yè)、工業(yè)和藥業(yè)。全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積和種類每年都在持續(xù)增長，但此項(xiàng)技術(shù)對生態(tài)環(huán)境、人類健康、倫理道德等可能帶來的問題尚不明確，先需進(jìn)行轉(zhuǎn)基因生物檢測和鑒別的相關(guān)技術(shù)研究。目前轉(zhuǎn)基因生物的檢測方法主要有DNA檢測和蛋白質(zhì)檢測兩大類，但這些方法存在較多不足，如操作

2、復(fù)雜，費(fèi)用高，且蛋白質(zhì)檢測方法只適合檢測未加工的產(chǎn)品等。近紅外光譜信息來源于有機(jī)分子中的含氫基團(tuán)(C—H、O—H和N—H)振動的合頻與各級倍頻的吸收，應(yīng)用其進(jìn)行檢測具有快速、無需復(fù)雜的樣品預(yù)處理、低價和易實(shí)現(xiàn)在線等優(yōu)點(diǎn)。
　　 轉(zhuǎn)基因番茄是第一個獲準(zhǔn)進(jìn)入市場的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品．本研究綜合利用光譜分析技術(shù)、分子生物學(xué)、植物生理學(xué)、光學(xué)和化學(xué)計(jì)量學(xué)等諸多領(lǐng)域的知識，以轉(zhuǎn)基因番茄(包括葉、果實(shí)、果汁和種子)及其親本為研究對象，進(jìn)行基于可見

3、/近紅外光譜技術(shù)的轉(zhuǎn)基因番茄快速無損鑒別和生理特性指標(biāo)(包括葉綠素和乙烯合成量)無損檢測的研究。用不同的模式識別方法(判別分析(Discriminant analysis，DA)、判別偏最小二乘法(Discriminant partial least squares，DPLS)、簇類的獨(dú)立軟模式分類法(Softindependent modeling of class analogy，SIMCA)、前饋反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(Backprop

4、agation neural network，BPNN)、徑向基函數(shù)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(Radial basis function neuralnetwork，RBFNN)和最小二乘支持向量機(jī)(Least sqares support vector machine，LS—SVM))進(jìn)行轉(zhuǎn)基因番茄與其親本的定性分析，同時對葉片中葉綠素含量和番茄果實(shí)的乙烯合成量等生理特性指標(biāo)與可見/近紅外光譜的相關(guān)性進(jìn)行研究，并利用主成分回歸(Principal c

5、omponents regression，PCR)、偏最小二乘回歸(Partial least squaresregression，PLSR)和多元線性回歸(Multi linear regression，MLR)建立定量模型。本文的研究目的在于證明利用可見/近紅外光譜分析技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因番茄快速無損鑒別和葉片中葉綠素含量及番茄乙烯合成量等生理特性指標(biāo)定量檢測的可行性，建立基于可見/近紅外光譜分析技術(shù)的轉(zhuǎn)基因番茄快速無損檢測方法體系，為研

6、發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)基因番茄高通量快速檢測儀器提供方法依據(jù)。
　　 主要研究內(nèi)容、結(jié)果和結(jié)論如下：
　　 (1)分析了光譜儀分辨率和掃描次數(shù)對近紅外光譜和建模結(jié)果的影響。結(jié)果表明：分辨率為4 cm—1和8 cm—1時所建立的番茄果實(shí)鑒別模型的識別率最高，為78.89％；隨著掃描次數(shù)的增加，光譜越來越光滑，均方根噪聲逐漸變小，方差值也逐漸變??；模型的識別率隨著掃描次數(shù)的增加而提高，掃描次數(shù)為128次時，模型的識別率最高；

7、在α=0.05水平上分辨率大小和掃描次數(shù)對番茄果實(shí)近紅外光譜噪聲的影響顯著，對吸光度的影響不顯著。
　　 (2)分析了轉(zhuǎn)基因番茄葉、果實(shí)、果汁和種子與其親本的光譜差異．結(jié)果表明：用配有InGaAs檢測器的Nexus智能型FT—NIR光譜儀所采集的轉(zhuǎn)基因番茄葉與其親本的漫反射光譜圖上顯示轉(zhuǎn)基因番茄葉的吸光度值在1380 nm前小于親本的吸光度值，但是在1380 nm后趨勢有所改變；用配有Si檢測器的Nexus智能型FT—NIR光譜

8、儀所采集的轉(zhuǎn)基因番茄葉與其親本的可見/近紅外漫反射光譜顯示轉(zhuǎn)基因番茄葉的吸光度值小于親本的吸光度值；用微型光纖光譜儀USB4000所采集的番茄葉透射光譜圖顯示轉(zhuǎn)基因番茄葉的透過率大于親本的透過率；2)同一成熟期成熟番茄的近紅外漫反射光譜圖顯示轉(zhuǎn)基因番茄的吸光度值較其親本高；不同成熟期番茄的可見/近紅外漫反射光譜圖顯示轉(zhuǎn)基因紅番茄的吸光度值大于其親本的吸光度值，轉(zhuǎn)基因青番茄的光譜與其親本在578 nm處交叉，在578 nm前，轉(zhuǎn)基因青番茄

9、的吸光度值大于其親本的吸光度值，在578 nm后，轉(zhuǎn)基因青番茄的吸光度值小于其親本的吸光度值；3)轉(zhuǎn)基因番茄汁與其親本的近紅外透射光譜極為相似，放大后能觀察到微小差異；4)轉(zhuǎn)基因番茄種子與其親本的近紅外原始光譜顯示光譜之間有微小差異。結(jié)果表明，無論是轉(zhuǎn)基因番茄葉、番茄果實(shí)、番茄汁還是番茄種子，它們的光譜與親本的光譜間確實(shí)存在差異。
　　 (3)比較了不同儀器和檢測方式對鑒別結(jié)果的影響。結(jié)果表明：1)用微型光纖光譜儀USB4000

10、采集的漫反射光譜建立的轉(zhuǎn)基因番茄葉與其親本的鑒別模型的判別正確率最高，最適合用于轉(zhuǎn)基因番茄葉與其親本的鑒別．2)對于同一成熟期的轉(zhuǎn)基因番茄與其親本的鑒別，使用USB4000采集的漫反射光譜建立的模型對樣本鑒別的正確率最高；對于不同成熟期的轉(zhuǎn)基因番茄與其親本的鑒別，同樣是用USB4000采集的光譜建立的模型的鑒別正確率要高于FT—NIR光譜儀采集的光譜建立的模型．
　　 (4)比較了不同模式識別方法對轉(zhuǎn)基因番茄葉、番茄果實(shí)、番茄汁

11、和番茄種子定性分析結(jié)果的影響．結(jié)果表明：1)對轉(zhuǎn)基因番茄葉與其親本的判別結(jié)果顯示，判別分析和判別偏最小二乘結(jié)合微分或標(biāo)準(zhǔn)規(guī)一化處理都可以實(shí)現(xiàn)對所有樣本的正確分類。2)同一成熟期轉(zhuǎn)基因番茄與其親本的判別結(jié)果顯示，判別分析建立的模型的鑒別效果最好，總體判別正確率為94％，前饋反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和最小二乘支持向量機(jī)模型的總體判別效果相同。對于不同成熟期的轉(zhuǎn)基因番茄與其親本的鑒別結(jié)果顯示，SIMCA法所建模型的鑒別總體效果最好，為86.08％。3

12、)對轉(zhuǎn)基因番茄汁與其親本的判別結(jié)果顯示，結(jié)合二階微分光譜，徑向基函數(shù)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和最小二乘支持向量機(jī)建立的模型預(yù)測精度最高，識別率均達(dá)到了100％。4)對轉(zhuǎn)基因番茄種子與其親本的鑒別結(jié)果顯示，在全波段，判別分析結(jié)合25點(diǎn)平滑處理光譜所建的轉(zhuǎn)基因番茄種子與其親本鑒別模型的性能最優(yōu)，對樣本鑒別的總體正確率達(dá)到了95.81％。結(jié)果表明，利用可見/近紅外光譜，可實(shí)現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因番茄與其親本的鑒別。
　　 (5)用連續(xù)投影算法提取光譜特征波長后重

13、新建立了轉(zhuǎn)基因番茄與其親本的鑒別模型。結(jié)果表明：隨著波長數(shù)的增加，模型的判別正確率逐漸增加，但是運(yùn)算所需的時間也逐漸增加。重建模型的結(jié)果顯示：與模型重建前相比，對于同一成熟期轉(zhuǎn)基因番茄與其親本的鑒別，判別偏最小二乘法的重構(gòu)模型的性能提高了，鑒別速度提高了45倍。對于不同成熟期轉(zhuǎn)基因番茄與其親本的鑒別，SIMCA方法建立的模型最優(yōu)，總體判別正確率為84.36％。結(jié)果表明，利用連續(xù)投影算法提取光譜的特征波長后重新建立轉(zhuǎn)基因番茄與其親本的鑒別

14、模型，可以提高鑒別速度。
　　 (6)對番茄葉葉綠素含量和番茄果實(shí)的乙烯合成量進(jìn)行了定量分析。在剔除光譜異常樣本和濃度異常樣本的基礎(chǔ)上，用PLSR、PCR和MLR方法建立了模型，比較了不同光譜預(yù)處理方法對模型的影響；對于番茄果實(shí)的乙烯合成量，還研究了不同建模波段對模型的影響。結(jié)果表明：1)番茄葉在全波段(670～1100 nm)的原始光譜所建的葉綠素含量的PLSR模型性能最優(yōu)，相關(guān)系數(shù)r、校正均方根誤差(Root meansqu

15、are error of calibration，RMSEC)、預(yù)測均方根誤差(Root mean square error ofprediction，RMSEP)和交叉驗(yàn)證均方根誤差(Root mean square error ofcross validation，RMSECV)分別為0.961、1.50、2.25和3.00.2)光譜經(jīng)多元散射校正后在全波段范圍內(nèi)所建的PLSR模型最適合于乙烯合成量的定量分析，模型的相關(guān)系數(shù)r達(dá)到了