茶樹(shù)自交不親和類(lèi)型的鑒定及相關(guān)基因克隆與表達(dá)分析.pdf

1、茶樹(shù)(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze）屬山茶科山茶屬，為多年生異花授粉植物。茶樹(shù)具有高度雜合性，而且生殖周期較長(zhǎng)，遺傳學(xué)中的純系自交、雜交等方法應(yīng)用相當(dāng)少，這也使得茶樹(shù)的遺傳學(xué)研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其它經(jīng)濟(jì)作物，從而使茶樹(shù)的遺傳學(xué)規(guī)律的研究受到阻礙。茶樹(shù)結(jié)實(shí)率低，自花授粉基本不育，表現(xiàn)出自交不親和性。因此，茶樹(shù)的自交不親和研究是茶樹(shù)遺傳育種中一個(gè)重要的基礎(chǔ)課題。
　　 本研究以茶樹(shù)為研究材料，從茶樹(shù)花粉的體外

2、保存與萌發(fā)條件、茶樹(shù)花粉管在自交和雜交后在花柱及在子房?jī)?nèi)的生長(zhǎng)與受阻情況、茶樹(shù)自交后與雜交后cDNA-AFLP差異分析、茶樹(shù)持家基因3-磷酸甘油醛脫氫酶克隆與熒光實(shí)時(shí)定量方法的建立，與茶樹(shù)自交不親和相關(guān)的茶樹(shù)鈣依賴(lài)型蛋白激酶基因(CsiCDPK)的克隆與表達(dá)鑒定等幾個(gè)方面對(duì)茶樹(shù)的自交不親和機(jī)理類(lèi)型與相關(guān)基因進(jìn)行了研究，主要結(jié)果如下:
　　 1、選取H3BO4、Ca(NO3)2、PEG-4000、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、山梨醇等碳源

3、和不同pH值作為參考因子對(duì)茶樹(shù)花粉的萌發(fā)進(jìn)行研究，結(jié)果表明茶樹(shù)花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的最適液體培養(yǎng)基是:0.01％硼酸，0.05％ Ca(NO3)2，5％ PEG-4000，5％麥芽糖，pH值在5.0～6.0之間(緩沖液30 mmol·L-1 MES)。在此條件下的茶樹(shù)花粉萌發(fā)率為82.24％，花粉管生長(zhǎng)長(zhǎng)度為492μm?；ǚ郾４嬗?℃5d內(nèi)發(fā)芽率仍有59.67％，適合短期保存，使用液N2冷凍后-70℃保存180d后萌發(fā)率仍有60.24％

4、,適合長(zhǎng)期保存。
　　 2、選取‘祁門(mén)種’、‘龍井長(zhǎng)葉’、‘福鼎大白茶’及‘藪北’等茶樹(shù)品種間進(jìn)行自交和雜交，授粉后不同時(shí)間對(duì)花柱組織及子房進(jìn)行采樣，通過(guò)苯胺藍(lán)熒光染色觀察花柱，對(duì)茶樹(shù)子房的進(jìn)行石蠟切片觀察。結(jié)果顯示，雜交與自交的花粉在授粉48h大多數(shù)花粉管均穿過(guò)花柱進(jìn)入子房組織;但雜交的茶樹(shù)花粉管能順利進(jìn)入子房，自交的花粉管則不能進(jìn)入，僅停留在子房腔內(nèi)。說(shuō)明茶樹(shù)的自交不親和可能與原先設(shè)想的配子體自交不親和機(jī)理不同，可能屬于延遲

5、型自交不親和(LSI)或子房自交不親和(OSI)。
　　 3、以未授粉茶樹(shù)雌蕊為對(duì)照，比較異交授粉后與自交授粉后cDNA-AFLP差異表達(dá)，通過(guò)比較選擇差異條帶進(jìn)行序列測(cè)定，并與Genbank中已知數(shù)據(jù)對(duì)比，對(duì)其中功能基因進(jìn)行分析，初步統(tǒng)計(jì)評(píng)價(jià)，找出已知并可能與自交不親和相關(guān)的基因序列15條，其中與自交授粉相關(guān)或信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)較為密切的有鈣依賴(lài)型蛋白激酶，衰老相關(guān)蛋白，G蛋白和細(xì)胞周期蛋白等。
　　 4、參照擬南芥、龍眼和

6、豌豆的GAPDH保守區(qū)設(shè)計(jì)GAPDH上游與下游引物，經(jīng)克隆，轉(zhuǎn)化，測(cè)序，比對(duì)，該片段的氨基酸序列與擬南芥、龍眼、豌豆的核苷酸序列的同源性分別為80％、83％、81％，利用3'和5'-RACE克隆了該基因全長(zhǎng)，3-磷酸甘油醛脫氫酶基因在多種植物中表達(dá)穩(wěn)定，可以作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR的內(nèi)標(biāo)基因使用。
　　 5、利用茶樹(shù)GAPDH為內(nèi)標(biāo)基因?qū)DNA-AFLP差異表達(dá)后的7個(gè)片段進(jìn)行差異表達(dá)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)這7個(gè)片段均能在自交24h后在子房

7、中特異表達(dá)。從中挑選1個(gè)片段研究對(duì)象，從獲得的差異圖譜中，克隆得到一個(gè)與茶樹(shù)自交不親和相關(guān)的鈣依賴(lài)蛋白激酶基因片段，然后用RCAE方法擴(kuò)增獲得其cDNA全長(zhǎng)序列，將其命名為茶樹(shù)CsiCDPK(Camellia sinensis calcium-dependent protein kinase)基因。該基因cDNA序列全長(zhǎng)2281bp，編碼760個(gè)氨基酸。用熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法進(jìn)一步研究該基因的功能，檢測(cè)其表達(dá)特異性，結(jié)果表明，該基因在