幾個種類蘭花的轉基因抗病毒新品種培育研究.pdf

1、蘭花是蘭科（Ocrhidaceae））植物的總稱，是開花植物中最大的一個科，屬于單子葉植物，是目前花卉中價值最高的種類之一。由于蘭花比較難以進行遺傳轉化，并且蘭科植物的花有許多獨有的特征，因此進行蘭花轉基因的研究不僅可以為蘭花分子生物學研究打下良好的基礎而且還有很大的商業(yè)利用價值，在基礎理論研究和實際應用方面都具有重要意義。
　　 本文以9個種類具有重要價值的蘭花（大花蕙蘭、卡特蘭、中國蘭屬附生種類等）為材料，應用農桿菌和基因槍

2、兩種轉化方法進行了轉基因研究。建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaic virus，CyMV）和齒蘭環(huán)斑病毒（Odontoglossum ringspot virus，ORSV）是危害蘭花的兩種主要病毒。為了使蘭花具有抗病毒病的優(yōu)良性狀，將分別攜帶CyMV和ORSV兩種病毒外殼蛋白基因的表達載體PBI121、PBI221分別轉化大花蕙蘭、卡特蘭、中國蘭屬附生種類等9個種類的蘭花。
　　 1.研究確定了各類蘭花的最佳抗生素篩

3、選濃度。表達載體中有新霉素磷酸轉移酶基因（NptⅡ）作為篩選標記基因，選擇具有抗卡那霉素的植株。大花蕙蘭的抗生素最佳篩選濃度為25 mg/L的卡那霉素.卡特蘭的抗生素最佳篩選濃度為25 mg/L的卡那霉素，中國蘭屬附生種類中的根狀莖抗生素最佳篩選濃度為50 mg/L的卡那霉素，類原球莖最佳篩選濃度為10 mg/L的卡那霉素。
　　 2.農桿菌侵染方法和合適的共培養(yǎng)時間，農桿菌浸泡在菌液中20 min較為適宜，共培養(yǎng)時間5天較為適

4、宜。
　　 3.基因槍轉化方法中所用微粒載體為直徑1.0μm鎢粉，轟擊壓力定為1100 psi，轟擊距離為9 cm、真空度為25 mgHg，基因槍轟擊后，恢復培養(yǎng)一周后，轉入含有卡那霉素的抗性篩選培養(yǎng)基，能有效的篩選出抗性苗。
　　 4.研究獲得的抗性植株進行了PCR檢測，設計了合適的PCR引物，并確定了適宜的PCR反應條件和體系，最終得到PCR水平的98個陽性株系。分析比較了農桿菌和基因槍兩種轉化方法，在抗性苗的出苗率