利用反向重復(fù)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)基因及其側(cè)翼序列轉(zhuǎn)化獲得雙抗病毒轉(zhuǎn)基因煙草.pdf

1、RNA沉默在植物上稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默，是植物固有的一種抵御病毒侵染的機(jī)制，它可以使侵染植物的病毒的RNA發(fā)生序列特異性的降解，從而使植物獲得抗性。為提高植物對(duì)病毒的抗性，人們用來源于病毒本身的基因作為轉(zhuǎn)基因材料創(chuàng)造轉(zhuǎn)基因植物。研究證明反向重復(fù)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)基因在植物中有更多機(jī)會(huì)可以轉(zhuǎn)錄形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的dsRNA，而dsRNA引發(fā)的RNA沉默在RdRp的作用下可以使沉默從雙鏈區(qū)向連接在雙鏈上的單鏈側(cè)翼序列延伸，使雙鏈及其連接在側(cè)翼的單鏈RNA序列一

2、起發(fā)生沉默。
　　 本研究通過分別在植物表達(dá)載體pRIR202反向重復(fù)結(jié)構(gòu)的上游側(cè)翼插入馬鈴薯X病毒（Potato virus X，PVX）CP基因全長序列構(gòu)建重組表達(dá)載體pRIR202XCP、下游側(cè)翼插入馬鈴薯X病毒基因組約2kb的單片段基因（包括CP基因至NIB基因的部分序列）構(gòu)建植物表達(dá)載體pRIR202-P2kII，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)化煙草；研究由反向重復(fù)結(jié)構(gòu)引起的 RNA沉默能否影響到反向重復(fù)轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)的側(cè)翼而獲得多

3、抗的轉(zhuǎn)基因植物。研究的主要結(jié)果和結(jié)論如下：
　　 1，構(gòu)建反向重復(fù)結(jié)構(gòu)側(cè)翼序列植物表達(dá)載體成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體pRIR202XCP和pRIR202-P2kII，將所構(gòu)建的重組植物表達(dá)載體pRIR202XCP和pRIR202-P2kII利用液氮凍融法直接導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404和GV3101，轉(zhuǎn)化煙草，獲得轉(zhuǎn)基因植株。
　　 2，抗病毒轉(zhuǎn)基因煙草的獲得及抗病性鑒定轉(zhuǎn)基因pRIR202XCP的植株獲得較高抗病行的轉(zhuǎn)基因煙草

4、植株，分子雜交結(jié)果證明轉(zhuǎn)基因植株的抗病性是由RNA沉默引起的，證明了由反向重復(fù)結(jié)構(gòu)引發(fā)的RNA沉默可以有效的影響該重復(fù)結(jié)構(gòu)上游側(cè)翼區(qū)域而同樣引發(fā)基因沉默，使轉(zhuǎn)基因植株獲得高度抗病性，從而獲得了高抗兩種病毒病的雙抗轉(zhuǎn)基因煙草植株。
　　 轉(zhuǎn)pRIR202-P2kII基因也成功獲得轉(zhuǎn)基因植株，初步的檢測(cè)證明外源基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入煙草基因組。而針對(duì)第一批移栽苗的初步抗病性測(cè)定結(jié)果表明有76％的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出對(duì)病毒的抗性。初步說明RNA沉默