脫氫表雄酮對肉雞肝臟脂肪代謝的影響及其細胞分子生物學(xué)機理研究.pdf

1、脫氫表雄酮（Dehydroepiandrosterone，DHEA）是類固醇激素合成過程的中間產(chǎn)物，在循環(huán)血液中主要以硫酸酯形式（Dehydroepiandrosterone sulfate，DHEA-S）存在.DHEA經(jīng)靶器官中相關(guān)酶系的作用，可轉(zhuǎn)化為多種類固醇激素。近年來因其廣泛參與機體內(nèi)一系列重要的生理反應(yīng)而日益受到重視.DHEA對脂代謝方面的影響已較為肯定，但對肉雞脂代謝方面的研究很少，其具體作用機理還不是十分清楚.本文選用生長

2、速度快、腹部脂肪沉積多的Arbor Acres肉雞（簡稱AA肉雞）為實驗動物，研究外源性DHEA對肉雞肝臟脂肪代謝的影響；通過建立雞胚原代肝細胞培養(yǎng)體系，探討DHEA對雞胚原代肝細胞脂代謝關(guān)鍵因子基因表達、cAMP/PKA信號通路及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的影響，為深入探討DHEA調(diào)控肉雞脂肪沉積作用提供實驗和理論依據(jù).
　　 1 DHEA對AA肉雞生產(chǎn)性能及相關(guān)代謝激素水平的影響
　　 180羽1日齡AA肉雞（38g左右）隨機分為

3、對照組，飼料中添加20mg/kg和5mg/kgDHEA的高、低劑量組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)20只.飼喂至42日齡分別從各組隨機選取12只公雞和12只母雞，采集血樣、肝臟、腹脂.試劑盒測定肝臟中甘油三酯(TG)、非酯化脂肪酸(NEFA)含量以及肝脂酶(HL)活性；RIA法測定血清三碘甲腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)、游離三碘甲腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)、胰高血糖素(Glucagon)、瘦素(Leptin)含量.結(jié)果顯

4、示，與對照組相比，DHEA顯著降低公、母肉雞體重和腹脂率，提高相對肝重；顯著降低肝臟中TG含量，提高HL活性和NEFA水平；DHEA可顯著降低公雞血清中T4、FT3、FT4的含量，顯著升高Glucagon和Leptin水平；同樣，DHEA可顯著降低母雞血清中FT3和FT4含量，顯著升高Leptin水平.結(jié)果提示，DHEA可能通過影響肉雞體內(nèi)脂類分解相關(guān)酶的活性及激素水平，對脂類代謝起調(diào)節(jié)作用，且這種作用存在性別差異。
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5、DHEA對AA肉雞肝臟脂肪代謝關(guān)鍵因子基因表達和肝組織超微結(jié)構(gòu)的影響與調(diào)節(jié)研究
　　 180羽1日齡AA肉雞(38g)隨機分為對照組，飼料中添加20mg/kg和5mg/kgDHEA的高、低劑量組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)20只.飼喂至42日齡時分別從各組隨機選取12只公雞和12只母雞，采集肝臟.RT-PCR半定量檢測肉雞肝臟脂肪代謝關(guān)鍵因子固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1（SREBP-1）、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、過氧化物酶體增殖物激

6、活受體α(PPARα)、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶Ⅰ(CPTⅠ)和脂酰輔酶A氧化酶1(ACOX1)基因mRNA水平；透射電鏡觀察肝組織超微結(jié)構(gòu).結(jié)果顯示，與對照組相比，DHEA對公、母雞肝臟SREBP-1和ACC表達水無明顯影響；DHEA顯著上調(diào)PPARα、CPTⅠ和ACOX1 mRNA水平；DHEA處理后可顯著增加公、母雞肝細胞中過氧化物酶體數(shù)目.結(jié)果提示，DHEA降脂的主要機理是通過提高脂肪分解代謝關(guān)鍵因子表達以及過氧化物酶體數(shù)量，加快脂肪酸

7、β-氧化進程，以減少脂肪在肝臟的合成。
　　 3 DHEA對雞胚原代肝細胞脂肪代謝關(guān)鍵因子基因表達和細胞超微結(jié)構(gòu)的影響與調(diào)節(jié)研究
　　 選用體外條件下培養(yǎng)的雞胚原代肝細胞為實驗對象，用含DHEA終濃度為0μmol/L、1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L的培養(yǎng)液孵育細胞。分別作用1h、2h、4h、6h、12h、24h、48h、72h及6d后吸出培養(yǎng)液，收集細胞，待測.RT-PCR半定量檢測肝細胞脂肪代謝關(guān)

8、鍵因子SREBP-1、ACC、PPARα和CPTⅠmRNA水平：透射電鏡觀察DHEA處理6d的肝細胞超微結(jié)構(gòu)；MTT法測定DHEA處理肝細胞24h、48h、72h后的細胞存活率.結(jié)果顯示，10μmol/L和100μmol/LDHEA處理肝細胞1h和2h能極顯著降低SREBP-1和ACC的mRNA水平，隨后開始上升，在4-48h內(nèi)與對照組相比沒有顯著性差異.10μmol/LDHEA在作用肝細胞1h和2h能極顯著降低PPARα的mRNA水平

9、，100μmol/LDHEA處理組則在2h顯著降低，隨后開始升高，在6-48h以上兩個處理組顯著提高PPARα的mRNA水平。10μmol/L和100μmol/LDHEA處理肝細胞1-4h對CPTⅠ的mRNA水平無顯著性影響，隨著作用時間的延長，6-48h內(nèi)CPTI的mRNA水平極顯著升高.1μmol/LDHEA處理組在各個時間點對上述基因mRNA水平均無顯著性影響；透射電鏡結(jié)果顯示，與對照組相比，10μmol/L和100μmol/LD

10、HEA使肝細胞中線粒體數(shù)目和基質(zhì)電子密度明顯提高；細胞存活率試驗表明，1μmol/LDHEA處理肝細胞72h顯著提高細胞存活率，與之相反，100μmol/LDHEA在各個時間點均顯著降低細胞存活率，10μmol/LDHEA處理組與對照組相比無顯著性差異.結(jié)果提示，10μmol/LDHEA在不影響肝細胞存活率的前提下，通過調(diào)控脂肪合成、分解代謝關(guān)鍵因子基因表達以及改變細胞超微結(jié)構(gòu)，增強脂肪酸β-氧化，加快脂肪酸動員，降低肝細胞脂肪的合成。

11、
　　 4 DHEA對雞胚原代肝細胞cAMP/PKA信號通路和相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的影響與調(diào)節(jié)研究
　　 選用體外條件下培養(yǎng)的雞胚原代肝細胞為實驗對象，用含DHEA終濃度為0mol/L、0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L的培養(yǎng)液孵育細胞，在作用20min后吸出培養(yǎng)液，收集細胞.RIA法檢測胞內(nèi)3’，5，-環(huán)腺苷酸（cAMP）含量.結(jié)果顯示，與對照組相比，0.1-100μ

12、mol/LDHEA組cAMP含量均顯著提高，其中0.1μmol/LDHEA組cAMP含量最高.因此，以0.1μmol/LDHEA為試驗組，分別在作用5min、10min、20min、30min和60min后收集細胞，分別檢測胞內(nèi)cAMP含量以及腺苷酸環(huán)化酶(AC)、磷酸二酯酶(PDE)和蛋白激酶A(PKA)活性；Westernblot法測定轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1蛋白水平和cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)磷酸化水平.結(jié)果顯示，O.1μ

13、mol/LDHEA作用肝細胞5-30min能顯著提高胞內(nèi)cAMP含量，且在20min達到最高，隨著作用時間的延長，到60min時與對照組相比并無顯著性差異。此外，試驗組PDE活性在10min和20min均顯著降低，而PKA活性在10min和20min顯著提高，AC活性在各個時間點均無顯著性差異；對相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的研究發(fā)現(xiàn)，DHEA處理可顯著降低雞胚原代肝細胞內(nèi)SREBP-1蛋白水平，而CREB磷酸化水平則顯著提高，且以上效應(yīng)均被PKA的抑