甘藍自交不親和性信號傳導元件MLPK與SSP編碼基因的FISH定位研究.pdf

1、甘藍等蕓薹屬植物的自交不親和性在遺傳上受一個帶有復等位基因的多態(tài)性S位點(S—locus)控制，并且存在著一個以S位點基因介導的自交不親和信號傳導途徑。但是，關于這條信號傳導途徑相關元件編碼基因之間的連鎖關系、以及它們與S位點的連鎖關系和在甘藍染色體上的具體位置分布至今未見報道。另外，甘藍是蕓薹屬的三個基本種之一，在蕓薹屬的自然和人工合成過程中，甘藍的染色體組參與的染色體配對行為十分普遍，染色體之間的重排率很高，極大地影響著甘藍自交不親

2、和基因在蕓薹屬間的轉(zhuǎn)移和遺傳變異。因此，對自交不親和基因進行染色體定位和DNA纖維定位，對蕓薹屬物種自交不親和性的研究和利用具有十分重要的意義。 本研究采用熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)技術，以MLPK和SSP基因片段為探針，分別在甘藍有絲分裂前中期染色體、減數(shù)分裂早粗線期染色體以及伸長DNA纖維(extended DNA fibers，EDFs)等3種分辨率水平的

3、靶DNA載體上進行全面的物理定位研究。旨在為孢子體型自交不親和性機理和信號轉(zhuǎn)導途徑的明確以及自交不親和性基因的遺傳變異的研究提供全新內(nèi)容，并為下一步甘藍高分辨率物理圖譜的構建和細胞遺傳圖譜的整合打下堅實的基礎。 主要研究結果如下： 1．通過對相關程序的探索優(yōu)化，建立了適合于甘藍的FISH靶DNA載體制備技術流程，利用該技術體系成功制備出甘藍有絲分裂前中期染色體、減數(shù)分裂早粗線期染色體以及伸長DNA纖維等3種層次的靶DNA

4、載體。 (1)本研究采用變溫處理同步化誘導方法，使甘藍有絲分裂前中期染色體分裂相比率達到80％以上，顯著的提高了前中期染色體制片的分裂相數(shù)目。 (2)甘藍根尖在20℃條件下，采用0.002mol/L8—羥基喹啉預處理1h，效果最佳。 (3)采用2％纖維素酶和2％果膠酶混合液37℃酶解約2h、0.075mol/L的KC1在25℃低滲30min的解離條件，制備的甘藍前中期染色體效果最佳；采用2％纖維素酶和2％果膠酶混

5、合酶液37℃解離約3h的方法，可獲得伸展良好、背景干凈的粗線期染色體。 (4)采用改進的細胞核提取方法，制備出了分布較均勻、密度合適的細胞核；STE細胞核裂解液作用時間須控制在5～8min；采用分子梳理法成功制備出伸展程度較均勻，大多呈平行狀態(tài)的DNA纖維。 2．通過對相關相關技術參數(shù)的探索，建立了適用于3種伸長度染色體的HSH技術體系。在前中期和早粗線期染色體上采用的FISH程序基本一致，而EDFs—FISH中，制片無

6、需進行前處理和預變性，雜交液中探針濃度以及雜交后洗脫溫度略有不同，其余程序在3種載體上可保持一致。實驗結果表明，均取得較好的雜交效果，證明該方法的可行性。 (1)染色體雜交前處理是否充分直接影響到原位雜交的信號檢出率和信噪比的高低。 (2)前中期及早粗線期染色體在70％去離子甲酰胺中，70℃變性2min，效果最佳；若變性時間稍長，對前中期染色體的影響更為明顯。 (3)FISH的最佳雜交液組成為：50％(v/v)去

7、離子甲酰胺、7.5％(v/v)硫酸葡聚糖、2×SSC、1.5ng/μL探針(EDFs—FISH0.5ng/μL)、0.5％(w/v)SDS、0.5μg/μLssDNA。 (4)針對單、低拷貝探針的3級洗脫，37℃獲得的雜交信號比較穩(wěn)定，信噪比較高。對于EDFs—FISH，將溫度提高到40℃，能更好地減少非特異信號，提高信噪比。 (5)利用抗體偶聯(lián)物進行信號的級聯(lián)放大，對于雜交信號檢出率的提高影響顯著。 3．在甘藍

8、前中期染色體上，MLPK與SSP探針都只在1對同源染色體上檢測到綠色雜交信號。MLPK與5SrDNA探針信號存在于同一對染色體上，位于1對近中著絲粒染色體的短臂中部：SSP探針信號位于1對具有隨體的近端著絲粒染色體的長臂端部。沒有觀察到同時出現(xiàn)在姊妹染色單體上的雙點信號現(xiàn)象。MLPK探針的檢出率為11.8％，SSP探針為9.1％。MLPK和SSP探針在甘藍減數(shù)分裂早粗線期染色體上，1個分裂相內(nèi)最多只觀察到2個同源雜交信號，探針信號的檢出

9、率分別為31.4％和20.4％。 4．本研究使用的伸長DNA纖維的分辨率約為1.5kb。在每條DNA纖維上，1.7kb的MLPK和1.2kb的SSP探針都呈現(xiàn)單個的綠色雜交信號點，推斷MLPK與SSP在1條DNA纖維(染色體)上可能只有1個拷貝。綜合分析MLPK與SSP在3種分辨率水平的靶DNA載體上的FISH結果判斷，在甘藍染色體組中MLPK與SSP基因可能都只有1個同源序列座位，初步證明二者在甘藍單倍體基因組中的單拷貝性。