MGB熒光定量PCR鑒別檢測豬瘟病毒及其動態(tài)分布規(guī)律研究.pdf

1、豬瘟又稱經(jīng)典豬瘟(Classical Swine Fever，CSF)，是由豬瘟病毒(Classical swine fevervirus，CSFV)引起豬的高度致死性、接觸性傳染病。本研究建立了CSFV野毒株與豬瘟兔化弱毒疫苗株(Hog Cholera Lapinized Virus，HCLV)的鑒別檢測方法，并完成了試劑盒的初步組裝。同時以豬的看家基因β—actin(ACTB)作為內(nèi)參，建立了CSFV核酸的相對定量PCR方法，并采用

2、該方法分析了CSFV石門株(SM)急性感染后的復(fù)制規(guī)律、動態(tài)分布規(guī)律和組織嗜件規(guī)律。 為了從定量的角度探討CSFV急性感染后病毒的復(fù)制規(guī)律、動態(tài)分布規(guī)律和組織嗜性規(guī)律，同時為CSFV鑒別檢測提供可靠的技術(shù)支持。本研究將熒光定量PCR(FQ—PCR)技術(shù)和ABI7500定量檢測系統(tǒng)相結(jié)合，對GenBank公布的CSFV全序列、牛病毒性腹瀉病病毒(BVDV)全序列和綿羊邊界病病毒(BDV)全序列進(jìn)行綜合比對，設(shè)計了一套針對CSFV野

3、毒株的特異TaqMan—MGB熒光探針和引物；同時，針對豬看家基因ACTB序列，設(shè)計了另一套特異性引物和探針作為內(nèi)參。經(jīng)過體系和反應(yīng)條件優(yōu)化，建立了一套相對定量CSFV核酸的FQ—PCR方法，CSFV和ACTB RNA擴(kuò)增效率分別為91.7％和92.4％，CT值與模板起始濃度對數(shù)之間的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均為0.998。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，該方法對BVDV、PRRSV、FMDV等9種豬相關(guān)病原核酸擴(kuò)增陰性，顯示良好的特異性，同時對5廠家6批

4、次HCLV疫苗核酸擴(kuò)增為陰性，避免了HCLV對實(shí)驗(yàn)的干擾，因此，該方法能鑒別檢測CSFV野毒株和HCLV株；該方法靈敏度比本實(shí)驗(yàn)室建立的RT—nPCR[1]．高1個數(shù)量級，檢測極限達(dá)5.3×10-2pg病毒核酸；30個質(zhì)控樣本在5個月內(nèi)的CT值變異系數(shù)為1.70～7.66％，均小于10％，說明該CSFV TaqMan—MGB PCR方法具有很好的穩(wěn)定性；對122份臨床疑似CSF的樣本檢測結(jié)果證實(shí)，該方法與RT—nPCR的符合率為94.3

5、％。同時我們用CSFV TaqMan—MGB PCR方法和豬瘟免疫熒光方法(HCFA)對北京某豬場800多份扁桃體樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果證實(shí)兩種方法具有較高的符合率。 采用4×103.84TCID50 SM血毒1ml，肌肉注射感染16頭60日齡長白豬，同時設(shè)立1頭陰性對照。感染全程進(jìn)行體溫監(jiān)測和臨床癥狀計分[2]，感染后每天隨機(jī)剖殺2頭，采集體內(nèi)各主要淋巴結(jié)、扁桃體、脾臟、腎臟、腸道、心肌、腦組織等共22種組織、器官，并采用2- C

6、T方法[3]．進(jìn)行CSFV RNA的FQ—PCR定量榆測，定量指標(biāo)為相對感染密度，即單位細(xì)胞內(nèi)感染病毒的核酸含量。定量檢測結(jié)果顯示：1．CSFV SM血毒感染24h后，感染豬22種組織、器官均能檢測出CSFV核酸；2．從感染后第1天到瀕死前第8天，22種組織、器官的CSFV感染密度均呈總體上升趨勢。與第1天比，回腸、肝臟和頜下淋巴結(jié)第8天的感染密度分別上升5.997、5.649和5.175個數(shù)量級，上升最快。上升最慢的為腎臟和肌肉，增幅

7、分別為1.432和0.797個數(shù)量級；3．CSFV在胰腺、腸系膜淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)、回腸、頜下淋巴結(jié)、脾臟、空腸、皮膚、肺、肝臟、扁桃體、直腸、回盲瓣、腎臟、脊髓、食道、膀胱、胃、十二指腸、肌肉、腦組織和心肌中的相對感染密度分別為5.069、5.053、4.964、4.925、4.843、4.792、4.514、4.076、4.034、3.989、3.919、3.830、3.711、3.580、3.555、3.188、2.935、2.

8、883、2.768、2.641、2.590和2.185個數(shù)量級。陰性對照豬上述組織、器官均未檢出CSFV核酸。 體溫監(jiān)測和臨床癥狀計分結(jié)果顯示：SM血毒感染后，從第2天開始，少數(shù)出現(xiàn)食欲下降、精神萎頓、體溫升高，其后體溫逐漸上升，此間臨床癥狀計分迅速增加，伴隨體溫升至41℃左右，稽留36-48h，其問食欲下降至廢厥，精神萎靡、站立不穩(wěn)，此后體溫開始回落；至頻死前第7-8天，臨床癥狀計分達(dá)最高值22-24，感染豬出現(xiàn)呼吸急促、消瘦

9、、倒地、抽搐；耳、鼻、四肢、腹部皮膚潮紅、瘀斑；至頻死期時體溫回落至39.5-40℃。整個病程的加重程度與病毒載量的增加里正相關(guān)。陰性對照豬體溫維持在39.5℃左右，無CSF臨床癥狀。 免疫組化檢測結(jié)果顯示，CSFV抗原信號在感染后24h即可在被檢22種組織、器官中檢測到，初期陽性信號主要集中于毛細(xì)血管內(nèi)，其后逐漸彌散到毛細(xì)血管外，進(jìn)入外周組織細(xì)胞內(nèi)，在胞內(nèi)出現(xiàn)陽性信號，且信號呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢。陰性對照豬試驗(yàn)期間呈健康狀態(tài)，未見陽性