非洲豬瘟病毒和古典豬瘟病毒雙重PCR及雙重熒光PCR檢測方法的建立與應用.pdf

1、非洲豬瘟和古典豬瘟都是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定的A類動物疫病。這兩種疫病都具有傳播速度快，破壞性強的特點，是嚴重危害畜牧業(yè)健康發(fā)展和畜產(chǎn)品國際貿(mào)易的烈性傳染病。我國目前屬于非洲豬瘟非疫區(qū)，豬瘟疫區(qū)。但是近幾年，非洲豬瘟在許多與亞洲接壤的歐洲國家頻繁爆發(fā)且有不斷蔓延趨勢，使我國對該病的防控形勢越來越嚴峻。由于非洲豬瘟和古典豬瘟的臨床癥狀極其相似，所以必須加強對非洲豬瘟的監(jiān)測防止其傳入我國。在當今世界貿(mào)易發(fā)展迅速情況下，快速、靈敏的分

2、子生物學方法就顯得尤為重要。為此，本研究建立了兩種可同時檢測這兩種病毒的PCR方法，可對進出口的豬肉及其制品進行嚴格的鑒別診斷，為我國畜牧業(yè)的健康發(fā)展提供有利的技術支持。
　　 參照GenBank中ASFV Tengani62分離株(登錄號AY261364)VP72蛋白的基因序列分別合成兩段基因片段p-ASFV-vp72和q-ASFV-vp72作為PCR和熒光PCR的反應模板，引物和探針參照《OIE陸生動物診斷實驗和疫苗手冊》非

3、洲豬瘟一章合成，將引物和探針序列在NCBI網(wǎng)站中進行Blast分析比較和評估，保證引物與探針的特異性，擴增片段分別為278bp和249bp。另根據(jù)GenBank中登錄的CSFV C株的全基因組序列，利用DNAStar中的MegAlign軟件進行排序、分析和比對，發(fā)現(xiàn)其5'UTR具有高度的保守性，在DNAStar的PrimerSelect和ABI primer express3.0軟件中分別進行PCR引物與熒光PCR引物和探針的設計和分析

4、。由于雙重熒光PCR反應中多條引物與探針之間的相互影響比單一熒光PCR復雜，因此特別關注了引物與探針之間的二級結構關系。針對此區(qū)域的序列設計的兩對引物和一條探針分別用于PCR和熒光PCR體系，擴增片段分別為438bp和120bp。在檢測ASFV的探針5'端和3'端分別標記了FAM熒光素和TAMRA熒光素，在檢測CSFV的探針5'端和3'端分別標記了VIC熒光素和TAMRA熒光素。
　　 由于ASFV是DNA病毒而CSFV是RNA

5、病毒，所以先構建了一個含有目的片段的CSFV的陽性質(zhì)粒，這個陽性質(zhì)粒也包含著熒光PCR反應針對的序列，所以既可以作為PCR反應的模板也可以作為熒光PCR反應的模板。通過對雙重PCR引物濃度、退火溫度等反應條件的優(yōu)化，篩選出最佳反應條件，建立雙重PCR檢測方法。對于雙重熒光PCR，主要對引物和探針的濃度比進行優(yōu)化，通過矩陣法篩選出最佳引物與探針的濃度比，建立雙重熒光PCR檢測方法，并對這兩種方法的特異性、敏感性和重復性進行了測定。結果表明

6、：只有特異性引物與其特異性模板才能擴增出目的片段，用此法檢測藍耳病病毒(PRRSV)，乙腦病毒(JEV)，圓環(huán)病毒(PCV)，細小病毒(PPV)偽狂犬病毒(PRV)結果均為陰性，說明這兩種方法都具有良好的特異性。對梯度稀釋的陽性質(zhì)粒的檢測可知所建立的熒光PCR方法對ASFV最低可檢測出10個拷貝，CSFV最低可檢出100個拷貝，普通PCR只能檢測到ng級別，說明熒光PCR方法敏感性比普通PCR方法至少高10倍。對從山東膠東地區(qū)豬場采集的