豬瘟病毒復(fù)合PCR檢測(cè)方法的建立和應(yīng)用.pdf

1、豬瘟（Classicalswinefever，CSF）是由豬瘟病毒（Classicalswinefevervirus，CSFV）引起的一種高度接觸性傳染病，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列入OIE疾病名錄（OIEListeddiseases），為須申報(bào)的（notifiable）動(dòng)物傳染病。近年來(lái)，我國(guó)豬瘟成為影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的一大隱患。CSFV跟同屬的牛病毒性腹瀉病毒1型（BVDV-1）、牛病毒性腹瀉病毒2型（BVDV-2）和綿羊邊界病病毒（BVD）

2、都屬于黃病毒科（Flaviriridae）瘟病毒屬（Pestivirus）的成員，由于瘟病毒屬其它成員大都可以感染豬，與CSFV存在血清學(xué)交叉反應(yīng)，而非洲豬瘟（ASF）在臨床上與豬瘟有很多相似之處，這些都給豬瘟診斷造成一定干擾。 疫苗免疫接種是預(yù)防豬瘟的主要措施。豬瘟兔化弱毒疫苗（HCLV）在我國(guó)的大規(guī)模應(yīng)用，為控制豬瘟起到了重要作用，但同時(shí)也給傳統(tǒng)的診斷方法特別是對(duì)CSFV野毒感染豬和疫苗接種豬的鑒別診斷帶來(lái)較大困難。目前，我

3、國(guó)豬瘟兔化弱毒疫苗的生產(chǎn)中兔脾淋疫苗質(zhì)量呈下滑趨勢(shì)，疫苗所必須的兔源大量減少，制備工藝粗糙，難以達(dá)到我國(guó)制定的疫苗效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)。豬瘟兔化弱毒細(xì)胞苗原定毒價(jià)標(biāo)準(zhǔn)只是國(guó)外標(biāo)準(zhǔn)的1/3，毒價(jià)低，若按說(shuō)明劑量應(yīng)用免疫效果差，達(dá)不到亞臨床保護(hù)效果。為了了解不同廠家的豬瘟兔化弱毒疫苗的效價(jià)，建立了檢測(cè)了CSFV的PCR方法，并進(jìn)行了初步估測(cè)。結(jié)果表明，13個(gè)不同廠家不同批次的16份疫苗中PCR的擴(kuò)增結(jié)果存在著較大差異，約1/3疫苗效價(jià)較低，免疫接種后

4、很可能導(dǎo)致免疫失敗，起不到預(yù)防豬瘟的作用；而且同一廠家不同批次的疫苗效價(jià)有較大差異，批次間質(zhì)量不穩(wěn)定。 本研究通過(guò)對(duì)GenBank中公布的34株CSFV野毒和疫苗毒基因組序列的比較分析，參照CSFV基因序列（AY805221），針對(duì)CSFVE2基因A1區(qū)域設(shè)計(jì)合成了一對(duì)引物，以HCLV疫苗株為模板，建立了CSFV的RT-PCR檢測(cè)方法。利用建立的方法檢測(cè)PRV、PPV、PCV-2，只有CSFV擴(kuò)增出預(yù)期的276bp的條帶，而其它

5、病毒未出現(xiàn)任何條帶，說(shuō)明了所建檢測(cè)方法的高度特異性。運(yùn)用所建方法對(duì)河南新鄉(xiāng)、周口、焦作等地CSFV病料進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，均可得到與預(yù)期大小276bp相符的特異性片段，同時(shí)用HinfⅠ對(duì)膠回收后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定，產(chǎn)物可被酶切成與預(yù)期大小相符的83bp和193bp兩條片段。 在上述RT-PCR的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)GenBank中公布的34株CSFV野毒和疫苗毒基因組序列的比較分析，在其保守區(qū)并包含強(qiáng)、弱毒差異性位點(diǎn)的5'

6、端非編碼區(qū)（可作為強(qiáng)毒與弱毒分子鑒別診斷的靶區(qū)域）設(shè)計(jì)了一對(duì)針對(duì)豬瘟疫苗毒的特異性引物，從而建立了能區(qū)分CSFV野毒和疫苗毒的復(fù)合RT-PCR鑒別診斷方法。 非洲豬瘟與典型的豬瘟都是急性、熱性、敗血性傳染病，臨床診斷上很易把二者相混淆。2007年4月-2008年7月先后有格魯吉亞、俄羅斯、車臣共和國(guó)、贊比亞、阿塞拜疆、坦桑尼亞等國(guó)家暴發(fā)非洲豬瘟疫情。我國(guó)目前雖是無(wú)ASFV感染的國(guó)家，但是作為俄羅斯的鄰國(guó)，時(shí)時(shí)刻刻都有被ASF波及