乙酰苯胺和2-氯苯磺酰胺誘導(dǎo)啟動(dòng)子IN2-2在植物中的表達(dá)研究.pdf

1、常見的植物化學(xué)誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)包括乙醇誘導(dǎo)系統(tǒng)、四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)、銅誘導(dǎo)系統(tǒng)、地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)等。受環(huán)境條件、誘導(dǎo)物穩(wěn)定性以及成本等眾多因素的影響，這些化學(xué)誘導(dǎo)系統(tǒng)大多停留在實(shí)驗(yàn)室研究范圍，幾乎未見在生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用。除草劑安全劑誘導(dǎo)系統(tǒng)與上述系統(tǒng)相比有明顯的優(yōu)點(diǎn)。首先，該系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)不需要特定轉(zhuǎn)錄因子參與，可以直接作用于啟動(dòng)子，誘導(dǎo)系統(tǒng)簡單易控;其次，誘導(dǎo)系統(tǒng)所用誘導(dǎo)物是除草劑安全劑，已在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用。因此該誘導(dǎo)系統(tǒng)有望在大田中得到

2、應(yīng)用。
　　來源玉米的IN2-2、IN2-1和IN5-2啟動(dòng)子能被乙酰苯胺類似物以及除草劑安全劑誘導(dǎo)表達(dá)。目前，主要在禾谷類作物和擬南芥上開展了相應(yīng)的研究工作。本研究將IN2-2啟動(dòng)子和GUS報(bào)告基因融合構(gòu)建載體，分別轉(zhuǎn)化煙草、芥菜和番茄。分別用乙酰苯胺和2-氯苯磺酰胺兩種化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行誘導(dǎo)處理，驗(yàn)證該啟動(dòng)子在上述植物中的誘導(dǎo)表達(dá)情況。并對(duì)轉(zhuǎn)基因番茄植株進(jìn)行42℃高溫處理，觀察啟動(dòng)子在環(huán)境脅迫下的表達(dá)穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)獲得以下結(jié)果:

3、>　　(1)轉(zhuǎn)基因芥菜植株的獲得
　　將載體PCABarIN2-2/GUS和PCABar35S/GUS對(duì)照載體用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入芥菜植株，獲得6株P(guān)CABarIN2-2/GUS轉(zhuǎn)基因芥菜植株和4株P(guān)CABar35S/GUS轉(zhuǎn)基因芥菜植株。
　　(2)轉(zhuǎn)基因煙草植株的獲得
　　將載體PCAKanIN2-2/GUS和PCAKan35S/GUS對(duì)照載體用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入煙草，獲得6株P(guān)CAKanIN2-2/GUS轉(zhuǎn)基因煙草植

4、株和3株P(guān)CAKan35S/GUS轉(zhuǎn)基因煙草植株。
　　(3)轉(zhuǎn)基因番茄植株的獲得
　　將載體PCAKanIN2-2/GUS用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入番茄，獲得12株P(guān)CAKanIN2-2/GUS轉(zhuǎn)基因番茄植株，并獲得T1代轉(zhuǎn)基因植株。
　　(4)乙酰苯胺誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因植株的GUS表達(dá)
　　乙酰苯胺能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因煙草葉片中IN2-2啟動(dòng)子控制的GUS表達(dá)，50mg/L和100mg/L誘導(dǎo)表達(dá)程度相當(dāng)，均比200mgL誘導(dǎo)表達(dá)強(qiáng)

5、。但三種濃度誘導(dǎo)表達(dá)強(qiáng)度都比35S啟動(dòng)子弱。
　　乙酰苯胺能誘導(dǎo)GUS基因在PCABarIN2-2/GUS轉(zhuǎn)基因芥菜種子發(fā)芽后的子葉和胚軸中表達(dá)。100mg/L誘導(dǎo)表達(dá)程度和35S啟動(dòng)子表達(dá)相當(dāng)。50mg/L和200mg/L誘導(dǎo)表達(dá)強(qiáng)度不如100mg/L。但乙酰苯胺處理后發(fā)芽時(shí)間較未處理對(duì)照野生型晚1-2天，顯示乙酰苯胺有一定的抑制種子發(fā)芽的作用。
　　乙酰苯胺能誘導(dǎo)IN2-2控制的GUS基因在番茄根、莖、葉和花中表達(dá)。GU

6、S組織化學(xué)染色顯示，在誘導(dǎo)第3天開始有表達(dá)，第5天誘導(dǎo)表達(dá)最強(qiáng)。但根和花中表達(dá)比莖和葉中強(qiáng)。50mg/L和100mg/L處理誘導(dǎo)效果好，200mg/L效果較差。GUS酶活性測(cè)定顯示，轉(zhuǎn)基因番茄葉片中100mg/L在處理第5天時(shí)，表達(dá)量最高92.7nmol/min/mg。
　　(5)2-氯苯磺酰胺誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因植株的GUS表達(dá)
　　2-氯苯磺酰胺對(duì)轉(zhuǎn)基因芥菜種子發(fā)芽有強(qiáng)烈抑制，種子胚軸不能伸長。但它能誘導(dǎo)芥菜萌發(fā)后種子子葉和胚軸中

7、IN2-2啟動(dòng)子控制的GUS表達(dá)，表達(dá)程度和35S啟動(dòng)子相當(dāng)。但在種皮中未能誘導(dǎo)GUS表達(dá)。
　　2-氯苯磺酰胺能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因番茄根、莖、葉和花中IN2-2控制的GUS基因表達(dá)。在誘導(dǎo)后第4或5天表達(dá)最強(qiáng)。GUS酶活性測(cè)定顯示，100mg/L濃度處理后3天，葉片中GUS活性達(dá)到最高表達(dá)量75.17nmol/min/mg。另外，200mg/L處理濃度對(duì)植株有藥害作用。
　　(6) PCAKanIN2-2/GUS轉(zhuǎn)基因番茄高溫脅迫