桑樹2個(gè)功能基因及啟動(dòng)子的克隆和表達(dá)模式分析.pdf

1、桑樹作為一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，幾千年以前就已被我國(guó)勞動(dòng)人民所用，并且我國(guó)擁有世界上最豐富的桑樹種質(zhì)資源。但是，對(duì)桑樹功能基因的研究卻仍處于起步階段，使桑樹的產(chǎn)量很大程度受到病蟲害和各種逆境條件的影響。因此，研究桑樹一些重要的功能基因及其在非生物脅迫條件下的分子作用機(jī)制，可以增強(qiáng)桑樹對(duì)各種脅迫條件的抗逆性，對(duì)提高桑葉產(chǎn)量和桑樹種質(zhì)資源的保存具有重要意義。
　　本文從已構(gòu)建的桑樹幼葉cDNA文庫(kù)中獲得了2個(gè)ESTs序列，并根據(jù)這二個(gè)已知

2、的ESTs序列設(shè)計(jì)相關(guān)的特異性引物，結(jié)合RT-PCR和RACE技術(shù)克隆得到了這2個(gè)基因的完整cDNA序列，并對(duì)獲得的全長(zhǎng)序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和功能預(yù)測(cè)，利用脅迫誘導(dǎo)和熒光定量PCR的方法對(duì)這2個(gè)功能基因進(jìn)行了功能驗(yàn)證。本論文針對(duì)這2個(gè)基因所做的主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　1、桑樹磷脂酰肌醇4,5二磷酸基因和啟動(dòng)子的克隆、序列分析及誘導(dǎo)表達(dá)分析
　　從已構(gòu)建的桑樹幼葉cDNA文庫(kù)得到了一個(gè)編碼桑樹磷脂酰肌醇4,5二磷酸(pho

3、sphatidylinositol(4,5)-bisphosphate,PIP2)基因的一段序列，通過(guò)RT-PCR首次獲得了這個(gè)基因的完整序列，并將其命名為MmPIP2（GenBank登錄號(hào):JN716318）。序列分析表明，該基因序列全長(zhǎng)1079 bp，存在102 bp的5’端非翻譯序列（5’-UTR）和128 bp的3’端非翻譯序列（3’-UTR），其開放讀碼框（ORF）長(zhǎng)849 bp，編碼282個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為29.

4、87 kD，等電點(diǎn)為8.91。同時(shí)以魯桑品種育71-1基因組DNA為模版,克隆得到PIP2基因的啟動(dòng)子片段。采用啟動(dòng)子序列分析軟件PLACE中的plant care軟件對(duì)其進(jìn)行序列結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果顯示啟動(dòng)子片段含有核心啟動(dòng)子序列，除典型的TATA-box、GATA-box以及CAAT-box等保守元件外，還有許多其他重要作用元件如AE-box、I-box和ABRE等。定量PCR結(jié)果表明，與正常生長(zhǎng)環(huán)境相比，MmPIP2基因和啟動(dòng)子mRNA

5、的轉(zhuǎn)錄水平在干旱、低溫、PEG-6000模擬干旱脅迫和鹽脅迫以及抗病感病幾種條件下均有所變化。
　　2、桑樹核糖體蛋白S3a基因的克隆、序列分析及誘導(dǎo)表達(dá)研究
　　從已構(gòu)建的桑樹幼葉cDNA文庫(kù)得到了一個(gè)編碼桑樹核糖體蛋白S3a(Ribosomal protein S3a，RPS3a)基因的一段序列，通過(guò)RACE與RT-PCR結(jié)合的方法首次獲得了該基因的完整序列，并命名為MmRPS3a。序列分析表明，MmRPS3a全長(zhǎng)108

6、9 bp，包含80bp的5’端非翻譯序列（5’-UTR）和220bp的3’端非翻譯序列（3’-UTR），其開放閱讀框（ORF）長(zhǎng)789bp，編碼262個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為30.053 kD，等電點(diǎn)為9.84。同源分析表明，MmRPS3a基因在桑樹與川桑、可可樹、蓖麻等各物種間具有很高的保守性?；谏浜推渌?5個(gè)物種RPS3a基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，魯桑與碧桃、擬南芥、馬鈴薯、番茄、葡萄的關(guān)系較近。定量PCR結(jié)果表明，MmRP