2-乙酰氨基芴誘導γH2AX焦點的形成.pdf

1、芳香胺類化合物2-乙酰氨基芴(2-acetylaminofluorene，2-AAF或AAF)是一種研究致突變劑和致癌物代謝活化的工具藥，廣泛運用于致突變致癌機制研究中。它作為間接遺傳毒物可被細胞色素P450家族(特別是CYP1A1/1A2)N-羥化為N-OH-AAF，然后與鳥苷酸C8的親核集團形成dG-C8-AAF、dG-C8-AF和dG-N2-AAF等DNA加合物，進而引起移碼突變、錯配等。除了與DNA形成加合物外，2-AAF還可誘

2、導DNA單鏈斷裂(singlestrandbreaks，SSB)、雙鏈斷裂(doublestrandsbreaks，DSBs)、鏈內、鏈間交聯(lián)等DNA損傷，其中DSBs是最嚴重的DNA損傷。 以往DSBs檢測方法脈沖電場凝膠電泳(pulsedfieldgelelectrophoresis，PFGE)、彗星實驗以及DNA洗脫實驗，雖然可以量化DSBs，但檢測效率比較低。近年來，γH2AX(gamma-H2AX，即磷酸化的H2AX)

3、被認為可以靈敏、有效地檢測DSBs。電離輻射(ionizingradiation，IR)誘導的DSBs導致組蛋白H2AX迅速發(fā)生磷酸化，大量磷酸化的H2AX募集其他DNA損傷修復蛋白到DSBs位點形成焦點復合物，并且γH2AX的數(shù)量和DSBs數(shù)量存在一一對應關系。另外，γH2AX焦點的形成與消失這一過程與DSBs的形成與修復密切相關。這些都提示γH2AX是一種靈敏檢測DSBs的指示劑。在IR誘導的γH2AX形成的過程中，磷脂酰肌醇3-激

4、酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)樣家族成員參與了H2AX的磷酸化。本實驗室曾用直接遺傳毒物單功能烷化劑N-甲基-N-亞硝基胍(N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG)處理FL和CHL細胞后，觀察MNNG對γH2AX焦點形成的影響，發(fā)現(xiàn)MNNG誘導γH2AX焦點形成具有時間、劑量效應。并且用彗星實驗驗證了以上結果。同時還用PI3K樣家族成員抑制劑渥曼青霉素(

5、wortmannin)與MNNG共同處理細胞，發(fā)現(xiàn)渥曼青霉素可抑制MNNG誘導γH2AX焦點形成，這說明PI3K樣家族成員參與了γH2AX焦點形成。 為了進一步研究γH2AX是否可作為檢測DNA損傷的優(yōu)良指標，本研究通過免疫熒光實驗觀察了2-AAF處理CHL與FL細胞后，γH2AX焦點形成與2-AAF之間的關系。隨后，我們用中性彗星驗證以上結果，并比較了γH2AX焦點與中性彗星實驗衡量DNA損傷程度的敏感性的大小。最后，我們也用

6、了渥曼青霉素，驗證它是否可以抑制2-AAF誘導γH2AX焦點形成。 2-AAF的細胞毒性作用具有時間、劑量效應：用2-AAF(0.1，1，5，10，20，50和100mg·L-1)處理CHL及FL細胞2，8和24h后，通過細胞毒性實驗測定2-AAF對兩種細胞系的細胞毒性。對照組用相同體積的溶劑二甲基亞楓(DimethylSulfoxide，DMSO)處理細胞。結果顯示，2-AAF對CHL、FL細胞生存率的抑制作用具有時間、劑量效

7、應。相對較高濃度(5，10，20，50和100mg·L-1)的2-AAF對CHL細胞的毒性作用隨時間的延長明顯增強。低濃度的2-AAF(0.1及1mg·L-1)則沒有明顯的細胞毒作用。2-AAF對FL細胞的毒性作用較小，只有50和100mg·L-12-AAF的細胞毒性作用較強。 2-AAF誘導CHL細胞的γH2AX焦點形成具有時間、劑量效應：我們用2-AAF(0.1，1，5和20mg·L-1)處理CHL和FL細胞10min，2，

8、8和24h后，通過免疫熒光實驗觀察2-AAF對γH2AX形成的影響。對照組用相同體積的溶劑DMSO處理細胞。10min時大部分空白組，對照組，0.1，1及5mg·L-12-AAF處理組的CHL細胞無γH2AX焦點形成，但20mg·L-12-AAF處理組中無論出現(xiàn)γH2AX焦點的細胞比例還是單個細胞內γH2AX焦點的數(shù)量都明顯增加；2h時20mg·L-12-AAF處理組γH2AX焦點的變化更加明顯，而其他濃度的2-AAF處理組對γH2AX

9、焦點仍然沒有顯著影響；8h時各濃度2-AAF處理組內γH2AX焦點形成都呈現(xiàn)顯著增加趨勢，此時0.1，1，5和20mg·L-12-AAF處理組中，γH2AX焦點數(shù)量大于20個的細胞占總細胞數(shù)百分比分別為4.6％，5.6％，8.0％，37.4％；但是在處理24h后，所有2-AAF處理組中γH2AX焦點數(shù)量及含有γH2AX焦點的細胞比例都回復到接近對照組的水平。然而，2-AAF處理FL細胞后，細胞核內γH2AX焦點數(shù)量以及含γH2AX焦點的

10、細胞數(shù)量無明顯改變。 中性彗星實驗證明2-AAF可引起DNA雙鏈斷裂：2-AAF(0.1，1，5和20mg·L-1)處理CHL和FL細胞10min，2，8和24h后，用中性彗星實驗來驗證2-AAF是否可引起DNA雙鏈斷裂。對照組用相同體積的溶劑DMSO處理細胞。在整個時間段內，在0.1，1和5mg·L-12-AAF處理組中，有彗尾細胞數(shù)量和彗尾長度與對照組無顯著差別。然而20mg·L-12-AAF處理組在8h時彗尾長度明顯增加，

11、有彗尾的細胞占總細胞百分比也增為84.0％。24h時這兩項指標都有下降。同時，中性彗星實驗也驗證2-AAF不能導致FL細胞的彗尾增長以及有彗尾細胞數(shù)量增加。 Wortmannin抑制了2-AAF誘導CHL細胞的γH2AX焦點形成：我們用免疫熒光實驗檢測Wortmannin和2-AAF共同處理CHL細胞后，PI3K樣家族和H2AX磷酸化的關系。經(jīng)過與Wortmannin共孵育后，2-AAF誘導γH2AX焦點形成的能力與只用2-AA

12、F處理相比明顯降低，因此Wortmannin能抑制2-AAF誘導的γH2AX焦點的形成。 結論：1.2-AAF可誘導CHL細胞中的γH2AX焦點的形成，并且2-AAF對γH2AX焦點形成的影響具有時間、劑量效應。 2.10min時，20mg·L-12-AAF已誘導CHL細胞中的γH2AX焦點的形成，而中性彗星實驗只有在8h時才出現(xiàn)彗尾增長；另外，各種濃度(20mg·L-1除外)2-AAF處理時可使γH2AX焦點數(shù)量增加，