一種啟動子探針載體的構(gòu)建及低溫誘導(dǎo)啟動子的研究.pdf

1、啟動子是基因表達調(diào)控的重要元件，也是基因工程表達載體的一個重要元件。啟動子克隆技術(shù)包括啟動子探針質(zhì)粒載體篩選啟動子和利用PCR技術(shù)克隆啟動子。
　　 綠色熒光蛋白是從多管水母體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，它可以在藍光或紫外光激發(fā)下發(fā)射綠光。由于它穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和光物理性質(zhì)，又易于在細胞內(nèi)表達，近些年作為標記物已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域。本文以質(zhì)粒pAcGFP為骨架，構(gòu)建以綠色熒光蛋白為報告基因的啟動子探針載體。用一段約700bp的基因片段插入pA

2、cGFP中取代其上的lac啟動子，獲得中間載體pEH+GFP。人工合成一段特異核糖體結(jié)合位點(RBS)序列插入到pEH+GFP中得到載體pEH+GFP+RBS。最終構(gòu)建成以綠色熒光蛋白為報告基因的啟動子探針載體pGFP+RBS，并用它從銅綠假單胞菌的總DNA中成功釣出一段具有啟動表達GFP的功能的基因片段，初步分析該片段為組成型啟動子。
　　 CspA是大腸桿菌中一種主要的冷激蛋白，近來研究人員對其結(jié)構(gòu)、功能和在轉(zhuǎn)錄、翻譯水平的

3、調(diào)控以及mRNA穩(wěn)定性等方面作了大量研究。本文用PCR技術(shù)克隆CspA啟動子構(gòu)建包含CspA冷激啟動子的低溫表達載體，用以在低溫條件下誘導(dǎo)表達目的蛋白。以大腸桿菌DNA為模板，用人工合成引物經(jīng)PCR擴增獲得大腸桿菌冷激蛋白CspA的低溫誘導(dǎo)啟動子(cold啟動子)片段，插入到表達型質(zhì)粒pET30a(+)的T7啟動子片段中，以取代pET30a(+)原有啟動子，構(gòu)建低溫誘導(dǎo)表達型載體pET30a/cold。通過克隆表達精氨酸脫亞胺基酶(AD