河南省部分地區(qū)賈第蟲病流行病學(xué)調(diào)查及分離株分子特征研究.pdf

1、賈第蟲是一種呈全球性分布的常見致腹瀉腸鞭毛原蟲,由列文·虎克(Leeuwen Hoek)于1681年發(fā)現(xiàn),宿主范圍廣泛,可引起包括人在內(nèi)的多種脊椎動(dòng)物腹瀉,通過食物和水傳播。本病呈世界性分布,自20世紀(jì)70年代以來,在世界各地發(fā)生了本病流行或暴發(fā)流行,因賈第蟲病曾在國際旅游者中流行,故被稱為“旅游者腹瀉”,現(xiàn)已將其列入全世界危害人類健康的10種主要寄生蟲病。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展,人與動(dòng)物直接或間接接觸機(jī)會(huì)越來越多,一些家畜和野生動(dòng)物作為本蟲

2、宿主對(duì)人類衛(wèi)生健康是一種潛在威脅。近年來,隨著人民生活水平的提高,旅游業(yè)和伴隨寵物的飼養(yǎng)得到快速發(fā)展以及世界上恐怖威脅的增加人們對(duì)食品和水安全的關(guān)注,賈第蟲病已經(jīng)越來越受到人們的重視。目前,我國尚未見賈第蟲分子流行病學(xué)和基因分型的系統(tǒng)報(bào)道,我國人賈第蟲是否由動(dòng)物傳播尚不得而知。筆者對(duì)河南省部分地區(qū)人賈第蟲感染進(jìn)行調(diào)查,并進(jìn)行分子遺傳特性研究,闡明人感染賈第蟲與動(dòng)物傳播之間的關(guān)系。
　　 1.初步掌握林州市大腸道寄生蟲感染情況,筆

3、者以林州8個(gè)地區(qū)作為調(diào)查點(diǎn),對(duì)共1949份糞便進(jìn)行腸道寄生蟲感染情況調(diào)查,共檢出蟲卵、卵囊和包囊6類,其中原蟲3種(賈第蟲、隱孢子蟲、球蟲)、線蟲3種(蟯蟲、蛔蟲、鉤蟲)。本次調(diào)查共發(fā)現(xiàn)26例腸道寄生蟲感染者,總感染率為1.33％(26/1949),其中賈第蟲感染率為0.41％(8/1949),隱孢子蟲感染率為O.15％(3/1949),蟯蟲感染率為0.56％(11/949),蛔蟲感染率為O.10％(2/1949),鉤蟲感染率為0.05

4、％(1/1949),等孢球蟲感染率為0.05％(1/1949),未發(fā)現(xiàn)其它寄生蟲及混合感染。
　　 2.初步掌握河南省部分地區(qū)人賈第蟲的流行情況和形態(tài)特征,筆者于2007年7月至2008年12月間用盧戈式碘液染色法對(duì)河南省人民醫(yī)院臨床病人、林州8個(gè)地區(qū)0～15歲的兒童、開封地區(qū)兩家大型醫(yī)院住院病人賈第蟲病的流行情況進(jìn)行了調(diào)查。共調(diào)查7519份樣品,發(fā)現(xiàn)23個(gè)人源賈第蟲分離株,總感染率為0.31％(23/7519)。年齡從剛出生1

5、天到高于100歲高齡,結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)其中以0～6歲與7～10歲這兩個(gè)年齡段的人感染率最高,其次是21～40歲,41～60歲和60～歲感染率相對(duì)較低,11～20歲感染率為零,不同年齡段人賈第蟲感染率存在顯著差異。從性別上看,男性的感染率為0.36％(14/3932),女性的感染率為0.25％(9/3587),不同性別差異不顯著。陽性樣品在盧戈式碘液中包囊呈橢圓形,囊壁較厚。碘液染色后呈黃綠色,囊壁與蟲體之間有明顯的空隙,未成熟的包囊有2個(gè)核

6、,成熟的包囊具4個(gè)核。囊內(nèi)可見到鞭毛、絲狀物、軸柱等。共測(cè)量106個(gè)賈第蟲包囊,大小約為7～10μm×8～13μm。
　　 3.根據(jù)賈第蟲TPI基因設(shè)計(jì)合成一套特異引物,對(duì)賈第蟲基因組DNA進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增,并對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化,成功擴(kuò)增出1條530bp左右長的目的片段,而其它3種寄生蟲DNA樣本均無此條帶出現(xiàn)。由此說明引物對(duì)賈第蟲基因組DNA的檢測(cè)具有高度的特異性。結(jié)果表明所建立的巢式PCR方法,可為賈第蟲病的臨床診斷和流行

7、病調(diào)查提供有意義的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 4.人源和動(dòng)物源賈第蟲PCR診斷,基于TPI基因?qū)幽系貐^(qū)人源和動(dòng)物源賈第蟲分離株進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增,巢氏PCR擴(kuò)增TPI基因530bp長度序列。擴(kuò)增結(jié)果表明,23份人源賈第蟲有20份特異性擴(kuò)增出產(chǎn)物,3份PCR陰性,22份動(dòng)物源賈第蟲全部擴(kuò)增出產(chǎn)物。
　　 5.利用生物信息學(xué)技術(shù)確定賈第蟲種類和基因型。對(duì)擴(kuò)增出的42個(gè)賈第蟲分離株的TPI基因部分序列進(jìn)行測(cè)序,序列分析表明,所研究的

8、20條人源賈第蟲序列之間存在差異性。11個(gè)分離株屬于聚集體A1,2個(gè)屬于聚集體A2,一個(gè)是聚集體B,與GenBank上發(fā)表的序列比較存在不同的堿基差異,命名為亞型B1。另外有4個(gè)分離株與聚集體A比較在不同堿基位點(diǎn)上存在差異,命名為亞型A4-A6。序列分析表明,22個(gè)動(dòng)物源賈第蟲分離株中有11個(gè)與藍(lán)氏賈第蟲聚集體A相同,另外11個(gè)與藍(lán)氏賈第蟲聚集體B相同。其中2個(gè)與聚集體A亞型1完全相同,1個(gè)與聚集體A亞型2完全相同,聚集體A中發(fā)現(xiàn)6個(gè)新

9、亞型,另有3個(gè)分離株在相同堿基位點(diǎn)上出現(xiàn)了差異,命名為A7；另外5個(gè)分離株在不同的堿基位點(diǎn)出現(xiàn)了差異,分別命名為A4、A8-A11；11個(gè)聚集體B中有6個(gè)分離株與聚集體B在不同堿基位點(diǎn)存在差異,為聚集體B新的亞型,分別命名為亞型B6-B9。
　　 結(jié)果表明,在藍(lán)氏賈第蟲內(nèi)部存在不同得基因型或基因亞型,河南省賈第蟲分離株共42株,通過分子鑒定表明存在17個(gè)不同的亞型,其中新亞型有14個(gè)。本試驗(yàn)結(jié)果為河南省賈第蟲病的流行情況和種類或