戊型肝炎流行病學調查與ORF2基因真核表達載體的構建及免疫效應研究.pdf

1、戊型肝炎（Hepatitis E，HE）是由戊型肝炎病毒（Hepatitis E Virus，HEV）引起的一種人和多種動物的人獸共患病。本論文首次應用斑點雜交（Dot—bot）技術確證了抗—HEV抗體IgG在寵物狗中的分布情況，并且以豬源HEV病毒的結構蛋白基因（ORF2）為切入點，成功構建了結構蛋白基因真核表達載體，且系統(tǒng)的研究了ORF2基因在細胞中的表達情況，以及對BaLB/c小鼠免疫效應。 目的：構建豬戊型肝炎病毒ORF

2、2基因的真核表達載體PCDQL和PCDPL，并在COS—7細胞中進行表達。通過肌肉注射與飽和蔗糖聯(lián)合免疫Balb/c小鼠，檢測其產生的免疫應答水平，期望通過基因疫苗作用使小鼠對戊肝病毒產生免疫防御能力。 方法：運用雙抗原夾心ELISA方法（DS—ELISA）檢測寵物狗血清樣品中HEV抗體，并且運用Dot—bot方法排除假陽性的存在。用RT—nPCR和Overlap—PCR的方法擴增ORF2全基因和其C端序列，將PCR產物純化后插

3、入pcDNA3.1（+）載體，構建重組質粒，將重組質粒PCDQL和PCDPL轉化入感受態(tài)細胞DH5α進行大量復制。轉染COS—7細胞，用免疫細胞化學和免疫印跡驗證其在真核細胞得到表達后，將重組質粒、對照空質粒pcDNA3.1（+）及生理鹽水分組通過肌肉注射免疫6周齡Balb/C雌鼠，隔兩周免疫一次，共免疫3次。初免后每隔2周采用ELISA間接法測定小鼠血清中抗HEVIgG抗體水平。 結果：檢測結果顯示，寵物狗總體陽性率約12.0

4、％，其中OD值最高為2.5，最低為0.01，臨界值為0.13，結果表明HEV在江浙地區(qū)寵物狗中有一定的流行，可能在HEV傳播中起到重要作用：在所構建的真核表達質粒中，PCDQL能夠很好的誘導機體產生免疫反應，免疫4周后約90％的小鼠產生抗—HEV抗體，重組質粒PCDPL也能誘導機體產生免疫反應，在免疫4周以后約有25％的小鼠產生抗—HEV抗體。與對照組差異顯著（P<0.05）。 結論： （1）斑點雜交試驗結果證實寵物狗血