PRRSV ORF5與PCV2 ORF2真核表達(dá)載體的構(gòu)建和PRRSV變異株的分離及序列分析.pdf

1、為了研究病毒編碼蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，并為山東省PRRS及PCV的防治提供一種理論和實(shí)際依據(jù)，本研究對(duì)PRRSV SD1株的ORF5和PCV SD2株的ORF2進(jìn)行了測(cè)序，根據(jù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞真核表達(dá)載體pIRES MCSA MCSB多克隆位點(diǎn)的序列和PRRSV SD1株ORF5和PCV SD2株的ORF2基因閱讀框架，同時(shí)考慮外源基因的表達(dá)量在基因起始密碼子的前面加入Kozak序列，分別設(shè)計(jì)了針對(duì)ORF5、ORF2的引物Y1/Y2，H1

2、/H2。將PCR產(chǎn)物ORF2經(jīng)雙酶切回收后插入真核表達(dá)載體pIRES得到pIRES-ORF2，RT-PCR產(chǎn)物ORF5經(jīng)雙酶切回收后插入pIRES-ORF2構(gòu)建成重組質(zhì)粒pIRES-ORF2/ORF5。經(jīng)PCR、RT-PCR、雙酶切及測(cè)序鑒定，證明成功構(gòu)建了轉(zhuǎn)移載體pIRES-ORF2/ORF5。 將構(gòu)建成功的pIRES-ORF20RF5重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞Marc-145，經(jīng)G418加壓篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，以P

3、CR、RT-PCR、和間接免疫熒光檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明：經(jīng)PCR、RT-PCR檢測(cè)到兩種目的基因的轉(zhuǎn)錄；間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)到目的蛋白在細(xì)胞漿和細(xì)胞核中觀察到了特異性的亮綠色熒光，證明蛋白得到表達(dá)。 首次在國(guó)內(nèi)將PRRSV ORF5與PCV2 ORF2同時(shí)插入哺乳動(dòng)物細(xì)胞真核表達(dá)載體并進(jìn)行成功表達(dá)，為構(gòu)建PRRSV與PCV雙基因真核表達(dá)載體的研究提供思路和依據(jù)。 從2006年6月份開(kāi)始，我國(guó)南方暴發(fā)了嚴(yán)重的豬

4、”高熱病”，目前已造成上千萬(wàn)頭豬只的死亡，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大損失。山東省于2006年12月份開(kāi)始暴發(fā)此病。通過(guò)細(xì)胞中傳代培養(yǎng)，分離出2株變異毒株，通過(guò)RT-PCR技術(shù)從中擴(kuò)增出PRRSV ORF5片段，并測(cè)其序列。應(yīng)用DNASTAR、DNAMAN序列分析軟件對(duì)所測(cè)的2株序列與北美洲原型(VR-2332株)、歐洲原型(LV株)和部分國(guó)內(nèi)外分離株的相應(yīng)片段進(jìn)行核苷酸同源性比較，差異較大，均為強(qiáng)毒株。從而為山東地區(qū)無(wú)名高熱PRRSV的控制及疫