大型綠藻-長石莼(緣管滸苔)細(xì)胞轉(zhuǎn)化與表達(dá)系統(tǒng)初步研究.pdf

1、本文比較系統(tǒng)地研究了長石莼（緣管滸苔）細(xì)胞轉(zhuǎn)化與表達(dá)系統(tǒng)：1）長石莼（緣管滸苔）離體細(xì)胞再生系統(tǒng)研究；2）長石莼（緣管滸苔）生長關(guān)鍵生態(tài)因子與條件優(yōu)化；3）草丁膦抗性基因（bar）在長石莼（緣管滸苔）細(xì)胞中導(dǎo)入與表達(dá)；4）綠色熒光蛋白（ZsGreen）基因在長石莼（緣管滸苔）細(xì)胞中導(dǎo)入與表達(dá)。這為今后建立我國石莼和滸苔的轉(zhuǎn)化與表達(dá)系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ)。 首先，研究了長石莼（緣管滸苔）離體細(xì)胞再生系統(tǒng)以及分化發(fā)育途徑。采用酶解技術(shù)將長石

2、莼（緣管滸苔）葉片細(xì)胞分離為單細(xì)胞，通過細(xì)胞培養(yǎng)觀察離體單細(xì)胞再生以及各種分化發(fā)育途徑。研究發(fā)現(xiàn)長石莼（緣管滸苔）主要存在3種分化發(fā)育途徑（6種類型）：1）部分原生質(zhì)體可直接分裂形成單細(xì)胞苗。其中包括有假根和無假根2種類型。2）部分原生質(zhì)體分裂成細(xì)胞團(tuán)，其中包括不規(guī)則細(xì)胞團(tuán)和規(guī)則細(xì)胞團(tuán)2種類型。不規(guī)則細(xì)胞團(tuán)的子細(xì)胞均可直接形成小苗而成苗簇，規(guī)則細(xì)胞團(tuán)囊壁較薄，類似孢子囊/配子囊，但不釋放孢子/配子，而是以子細(xì)胞直接萌發(fā)小苗形式發(fā)育，最后

3、形成苗簇。3）部分原生質(zhì)體可發(fā)育為孢子囊/配子囊2種類型，其中部分孢子囊/配子囊成熟后釋放出游孢子/配子，孢子直接形成小苗，而配子可進(jìn)一步接合為合子直接形成小苗。大部分配子是以正面結(jié)合，少數(shù)也可以首尾交錯結(jié)合。并觀察到某些配子也可直接形成小苗。 其次，利用脈沖振幅調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x研究了不同光照和溫度對長石莼（緣管滸苔）藻體生長及光合作用的影響，進(jìn)而對藻體生長培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，長石莼（緣管滸苔）在25℃和72μmol·

4、m-2·s-1條件下，其Fv/Fm、Fm、Fv、α和生長率值最高，分別高達(dá)0．74、4567、3406、0．305和228％，低于該點(diǎn)為光不飽和，高于為光抑制，偏離越大，光合作用和生長越受影響，下降越顯著（P<0．01），其中在5℃和35℃時(shí)最小，分別是25℃最高值的9．88-64．88％和22．99-53．44％；光強(qiáng)為18μmol·m-2·s-1和216μmol·m-2·s-1時(shí)最小，其Fv/Fm、Fm、Fv、α和生長率分別是25℃

5、72μmol·m-2·s-1最高值的7．02-82．62％和51．82-76．72％。F0變化不太明顯，5-30℃為先上升后下降或再上升變化趨勢，35℃為先下降后上升變化趨勢。擬合參數(shù)α顯示，長石莼（緣管滸苔）在達(dá)到光飽和點(diǎn)前通過增加光能吸收來增強(qiáng)光合作用，在光抑制后則迅速減少。rETRmax Duncan檢驗(yàn)表明，高溫/低溫和高光強(qiáng)對長石莼（緣管滸苔）光合作用影響顯著（P<0．01）。總體上看，長石莼（緣管滸苔）光合作用和生長適宜條件

6、為15-25℃和54-72μmol·m-2·s-1，過高或過低均不適宜，且溫度排序?yàn)?5>20>15>30>10>5>35℃，光照強(qiáng)度排序?yàn)?2>54/108>36/162>18/216μmol·m-2·s-1。 再次，通過PEG法介導(dǎo)將含有bar抗性篩選基因的pSVB載體導(dǎo)入到原生質(zhì)體中并獲得穩(wěn)定表達(dá)，成功地建立了bar基因抗性篩選轉(zhuǎn)化體系。將構(gòu)建的含有bar抗性篩選基因（啟動子為SV40）的pSVB載體通過PEG法介導(dǎo)導(dǎo)入到

7、Ulva linza原生質(zhì)體中，通過細(xì)胞培養(yǎng)再生成株。1周后用含有5ppm BastaVSE培養(yǎng)液進(jìn)行壓力篩選，成功篩選到抗Basta的轉(zhuǎn)化細(xì)胞（或藻株），且相對轉(zhuǎn)化率達(dá)到了31．58％。繼續(xù)將含Basta VSE培養(yǎng)液對轉(zhuǎn)化小苗進(jìn)行壓力篩選，并從中挑選出陽性藻株進(jìn)行bar基因PCR分子檢測，發(fā)現(xiàn)壓力篩選1個月和12個月的轉(zhuǎn)化藻體總DNA均得到了預(yù)期的陽性信號，其序列與GenBank中一致；進(jìn)一步用Southern雜交檢測，也發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化藻

8、株基因組DNA中同樣獲得陽性信號。表明bar抗性篩選基因在啟動子SV40作用下可以獲得瞬間表達(dá)，并也獲得了穩(wěn)定表達(dá)，成功建立了轉(zhuǎn)基因藻株的抗性篩選體系。 最后，利用構(gòu)建的含有綠色熒光蛋白基因達(dá)到載體PSV-bar-ZsGreen導(dǎo)入到原生質(zhì)體中并得到表達(dá)，以建立轉(zhuǎn)基因藻株綠色熒光蛋白檢測體系。應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增了pZsGreen1-N1質(zhì)粒熒光蛋白片段，并構(gòu)建了帶綠色熒光蛋白ZsGreen為檢測基因的表達(dá)載體PSV-bar-Zs