瘤胃蛋白質(zhì)降解相關(guān)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的解析.pdf

1、瘤胃蛋白質(zhì)降解相關(guān)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的解析研究生：盧玉飛導(dǎo)師：王加啟研究員趙國琦教授(揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院)摘要瘤胃內(nèi)日糧蛋白質(zhì)的降解是許多不同的微生物分泌的酶共同參與的復(fù)雜過程，尤其是細(xì)菌。盡管瘤胃內(nèi)蛋白質(zhì)的降解為瘤胃微生物的生長提供了所需的肽和氨基酸，被用來合成微生物蛋白，但仍有部分蛋白被降解為氨排出體外，導(dǎo)致氮的嚴(yán)重流失。本研究利用體外厭氧培養(yǎng)法、DGGE和16SrDNA文庫方法，研究不同氮源對瘤胃蛋白降解菌產(chǎn)氨速率的影響，分析蛋

2、白降解菌的種類和多樣性，有助于揭示蛋白質(zhì)在瘤胃內(nèi)降解的微生物機(jī)理，為減緩蛋白降解速率，增加氮利用率提供理論依據(jù)。試驗一：不同氮源條件下蛋白質(zhì)降解菌的產(chǎn)氨量分析為了研究在氮源下，分析不同蛋白質(zhì)降解菌的產(chǎn)氨效果，為蛋白質(zhì)降解菌的多樣性分析提供基礎(chǔ)比對數(shù)據(jù)。本試驗利用體外厭氧培養(yǎng)方法，以酪蛋白和酸水解酪蛋白為不同氮源，添加莫能菌素進(jìn)行不同脫氨酶活性蛋白降解菌連續(xù)21h的富集培養(yǎng)，試驗處理分為：NN，對照組；P，酪蛋白組；PM，酪蛋白加莫能菌素

3、組；AA，酸水解酪蛋白組；AAM，酸水解酪蛋白加莫能菌素組。通過測定培養(yǎng)基中0、7、14和21h氨氮變化量確定不同脫氨酶活性的蛋白質(zhì)降解菌氨產(chǎn)生速率的變化。酸水解酪蛋白作為氮源時的產(chǎn)氨率(43904nmolm91h1)高于酪蛋白作為N源時的速率(3934nmolmgdh1)(P005)。莫能菌素在7h后能抑制酸水解酪蛋白的產(chǎn)氨量，在14h后抑制酪蛋白的產(chǎn)氨量，且21h后，莫能菌素可顯著抑制氨的產(chǎn)生速率(P005)，相比于酪蛋白，更傾向于

4、抑制酸水解酪蛋白作為氮源和能量的來源。試驗二：DGGE分析不同氮源條件下蛋白質(zhì)降解菌的種類和多樣性為解析蛋白降解菌的種類和多樣性，闡明不同氮源對蛋白降解菌群落結(jié)構(gòu)的影響。通過體外法添加不同氮源，在試驗一的基礎(chǔ)上，分析氨產(chǎn)生速率有顯著差異的時間點，即21h采集培養(yǎng)基樣品，提取DNA，利用通用引物擴(kuò)增蛋白降解菌16SrDNAV3區(qū)，進(jìn)行DGGE圖譜分析，挑取差異顯著性條帶進(jìn)行割膠回收，然后將目的基因片段連接載體pMD19T，轉(zhuǎn)化EcoliJ