家蠶免疫系統(tǒng)相關(guān)基因的鑒定及其誘導(dǎo)表達(dá)模式研究.pdf

1、家蠶是典型的鱗翅目模式昆蟲，也是一種完全依靠人類飼養(yǎng)才得以生存的重要經(jīng)濟(jì)昆蟲，其基礎(chǔ)研究有著良好的積累，并保存有大量的突變體及繁育系。對家蠶免疫相關(guān)基因的研究，不僅可以促進(jìn)人們了解家蠶免疫應(yīng)答的分子調(diào)控機(jī)制，也可以促進(jìn)人們對昆蟲的分子調(diào)控機(jī)制的理解，并為昆蟲免疫分子的多樣性研究提供線索。借鑒果蠅的免疫研究成果，利用家蠶基因組精細(xì)圖、基因芯片和EST等多種家蠶的數(shù)據(jù)資源，通過生物信息學(xué)分析，我們對家蠶的免疫系統(tǒng)相關(guān)基因進(jìn)行了鑒定，對一些關(guān)

2、鍵基因進(jìn)行了克隆，并對關(guān)鍵基因家族進(jìn)行了比較和系統(tǒng)進(jìn)化研究，重點(diǎn)探討了它們的免疫誘導(dǎo)表達(dá)模式和功能，最后對家蠶免疫應(yīng)答的分子機(jī)制進(jìn)行探討。獲得的主要研究結(jié)果如下： 1.家蠶的免疫系統(tǒng)相關(guān)基因 采用果蠅和按蚊所有免疫相關(guān)基因在家蠶基因組中進(jìn)行同源性分析的方法，鑒定家蠶的免疫系統(tǒng)相關(guān)基因。我們鑒定了家蠶21個基因家族的218個免疫相關(guān)基因，主要包括：(1)模式識別受體，如PGRP、GNBP、凝集素和清道夫受體等基因家族；(2

3、)4個信號傳導(dǎo)途徑的相關(guān)基因：如Toll途徑的Spz、Toll、MyD88、Pelle、Tube、TRAF2和Cactin，Imd途徑的FADD、Dredd、TAK1、TAB、IKKβ、IKKΥ和Relish，JAK/STAT途徑的Domeless、Hopscotch和STAT：(3)7類抗菌肽家族的基因。其中，大約65％的基因具有EST表達(dá)證據(jù)；大約90％的基因已經(jīng)定位到相應(yīng)的染色體上，這為將來的基因功能研究提供了重要信息。系統(tǒng)進(jìn)化分

4、析發(fā)現(xiàn)家蠶的免疫相關(guān)基因在昆蟲中都很保守。模式識別受體和抗菌肽基因則具有明顯的物種特異性，在家蠶基因組中具有多個物種特異的拷貝，序列分化和物種特異的基因重復(fù)現(xiàn)象明顯，暗示它們受到更小的環(huán)境選擇壓力。同時，發(fā)現(xiàn)45個家蠶-果蠅-按蚊-蜜蜂的1：1：1：1的直系同源基因，其中，信號傳導(dǎo)途徑的基因都顯示1：1：1：1直系同源關(guān)系，推測家蠶擁有與果蠅等其它昆蟲類似的免疫應(yīng)答信號傳導(dǎo)機(jī)制。 2.基于全基因組芯片的免疫誘導(dǎo)表達(dá)譜分析

5、 本研究運(yùn)用包含22987個基因探針的全基因組芯片，通過大腸桿菌(革蘭氏陰性細(xì)菌)和蘇云金芽孢桿菌(革蘭氏陽性細(xì)菌)誘導(dǎo)5齡第3天家蠶幼蟲，在4個時間點(diǎn)對脂肪體進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組比較分析。芯片掃描結(jié)果顯示，總共有9961個探針有表達(dá)信號(信號值＞400)，占總探針數(shù)的43.3％，與此前的組織芯片結(jié)果相似。采用ratio＞2倍的標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因，我們獲得了210個上調(diào)表達(dá)的基因和200個下調(diào)表達(dá)的基因。通過基因功能分類，結(jié)果顯示上調(diào)表達(dá)的基

6、因主要是免疫應(yīng)答相關(guān)基因，包括模式識別受體、抗菌肽基因、絲氨酸蛋白酶及其抑制劑相關(guān)基因、黑化級聯(lián)相關(guān)基因和調(diào)摔鐵元素代謝的基因等。而下調(diào)表達(dá)的基因主要是一些能量代謝和生化酶類基因，包括細(xì)胞色素P450超家族的基因、表皮蛋白基因、低密度脂蛋白、激素相關(guān)基因、動力相關(guān)蛋白編碼基因，以及與常規(guī)代謝有關(guān)的酶基因等。這種表達(dá)模式反映了昆蟲脂肪體組織作為免疫應(yīng)答器官的生理特征。 3.家蠶的Toll相關(guān)受體基因家族 Toll受體在先天

7、免疫和發(fā)育中有重要作用，它們含有胞外亮氨酸富集結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)的TIR結(jié)構(gòu)域，在昆蟲和脊椎動物中都非常保守。通過與果蠅的Toll受體比較，發(fā)現(xiàn)家蠶基因組中含有13個Toll樣受體，分別命名為BmToll、BmToll-2到11、BmToLK-1和BmToLK-2。染色體定位顯示有8個成員位于第23號染色體上，其中BmToll、BmToll-2和BmToll-7是家蠶特有的亞群。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，家蠶的Toll受體與其它昆蟲的基因明顯形成7個

8、進(jìn)化亞群，其中，BmToll-6、BmToll-8和BmToll-9與果蠅和按蚊的基因呈明顯的直系同源關(guān)系。通過組織和發(fā)育時期的基因芯片數(shù)據(jù)分析，結(jié)果表明BmToll和BmToll-2在卵巢中富集表達(dá)，暗示其可能在胚胎發(fā)生中起重要作用：而BmToll-2和BmToll-4在幼蟲的中腸富集表達(dá)，推測它們可能參與免疫防御。另外，BmToll-10和BmToll-11和BmToLK-2在精巢特異表達(dá)暗示它們可能與性別特異的生物學(xué)功能有關(guān)。同時

9、，我們采用RT-PCR技術(shù)檢測了10個Toll基因在大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白僵菌誘導(dǎo)下的表達(dá)譜，結(jié)果顯示絕大多數(shù)基因存在表達(dá)差異。如在注射大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的樣品中BmToll的表達(dá)明顯被抑制；而BmToll-2則是在注射大腸桿菌和白僵菌的樣品中表達(dá)量明顯下調(diào)。相反，BmToll-3的表達(dá)量在三組誘導(dǎo)樣品中都明顯上調(diào)。家蠶Toll受體的鑒定和表達(dá)譜分析，將為我們研究Toll相關(guān)受體的生物學(xué)功能和Toll信號傳導(dǎo)途徑的分子機(jī)制提

10、供幫助。 4.家蠶的抗菌肽基因家族 通過與已報道的昆蟲抗菌肽的同源性分析，我們發(fā)現(xiàn)家蠶基因組總共包含有39個抗菌肽基因，包括12個Moricins、12個Cecropins、7個Gloverins、3個Attacins、2個Lebocins、2個Enbocins和1個Defensin。其中，Moricin和Gloverin為鱗翅目昆蟲特有的抗菌肽基因家族，并且成簇分布在基因組上。序列相似性和染色體定位信息表明，家蠶的抗菌

11、肽基因是由祖先基因經(jīng)歷了多次復(fù)制產(chǎn)生的基因家族。而這種物種特異的基因復(fù)制現(xiàn)象有可能反映了抗菌肽基因在免疫系統(tǒng)中起著非常關(guān)鍵的作用，因而產(chǎn)生多個基因拷貝以抵御不同的病原微生物。 5.家蠶抗菌肽基因的系統(tǒng)進(jìn)化和誘導(dǎo)表達(dá)模 家蠶基因組包含了比其它昆蟲更多的抗菌肽基因，其中Moricin、Cecropin和Gloverin等三個基因家族都含有多個拷貝。通過計算編碼序列的同義突變和非同義突變，發(fā)現(xiàn)這些基因家族的同義突變/非同義突變

12、(dN/ds)都小于1，分別為0.637、0.487和0.202，并且信號肽的比值比成熟肽的比值明顯更大，暗示了成熟肽趨于更強(qiáng)的穩(wěn)定性選擇。在這三個家族中，受到的進(jìn)化負(fù)選擇壓力大小關(guān)系為Moricin＜Cecropin＜Gloverin。結(jié)合抗菌譜和誘導(dǎo)表達(dá)活性的差異分析，發(fā)現(xiàn)選擇壓力小的Moricin和Cecropin家族成員之間的抗菌譜和誘導(dǎo)表達(dá)活性的差異明顯比Gloverin家族的更大。二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，Moricin和Ce

13、cropin家族都由α-螺旋組成，而正選擇位點(diǎn)也主要位于該區(qū)域。 通過家蠶抗菌肽的抗菌活性和誘導(dǎo)表達(dá)差異與序列差異的關(guān)聯(lián)分析，我們可以得出如下推論：家蠶抗菌肽基因家族可能存在主要抗菌功能基因的強(qiáng)免疫誘導(dǎo)模式。家蠶的抗菌肽Moricin、Cecropin和Gloverin基因可能通過不等交換產(chǎn)生多拷貝基因家族。并且在與微生物的協(xié)同進(jìn)化過程中，抗菌肽基因的編碼序列受到不同的選擇壓力，導(dǎo)致部分氨基酸的改變，從而改變抗菌肽的分子結(jié)構(gòu)和相

14、應(yīng)的靜電勢。這些變化最終導(dǎo)致抗菌肽家族成員間的抗菌譜和抗菌活性的差異。例如，Cecropin家族和鱗翅目特異的Moricin家族是由序列差異導(dǎo)致抗菌活性和誘導(dǎo)表達(dá)差異的典型家族，BmcecBJ、BmcecD和BmmorA1等三個基因都具有高抗菌活性和高誘導(dǎo)表達(dá)的特點(diǎn)，推測它們可能承擔(dān)了主要的抗菌功能，其它成員可能具有協(xié)同抗菌功能。而鱗翅目特異的Gloverin家族的序列分化比前兩個家族小，功能上的分化也不如它們明顯，并不完全符合高抗菌活

15、性和高誘導(dǎo)表達(dá)的規(guī)律。例如，BmglvA2符合高抗菌活性和高誘導(dǎo)表達(dá)的規(guī)律，而BmglvB具有較高的抗菌活性，但是誘導(dǎo)表達(dá)水平卻相對最低。家蠶抗菌基因家族的這種特征可能為基因家族的分子進(jìn)化以及功能分化的理解和由復(fù)制而來的新基因的命運(yùn)提供了一個很好的研究模式。 6.家蠶抗菌肽基因表達(dá)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 綜合上述分析，初步提出家蠶的抗菌肽基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其步驟大致可分為4個：首先，家蠶在受到細(xì)菌感染時，模式識別受體PGRPs和GN