家蠶免疫相關(guān)基因BmMyD88的功能初探.pdf

1、家蠶的馴化已有千年歷史，在漫長的馴化過程中，家蠶不僅僅作為泌絲織綢的經(jīng)濟(jì)物種，也是一種文化符號影響了千百年來的華夏文明。然而，蠶病所帶來的危害卻一直影響著整個(gè)蠶桑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，我國每年約有近百億左右的經(jīng)濟(jì)損失是由于各種蠶病造成的。近年的研究表明，當(dāng)家蠶感染微生物后，家蠶體內(nèi)經(jīng)過一系列復(fù)雜的信號調(diào)控通路產(chǎn)生出多種抗微生物的多肽以應(yīng)對微生物的入侵。其中，主要通過Toll和Imd兩個(gè)重要的信號調(diào)控通路來進(jìn)行微生物入侵危險(xiǎn)信號的傳導(dǎo)以及激活抗菌肽

2、表達(dá)，從而進(jìn)行體液免疫防御。我們通過對家蠶免疫相關(guān)Toll信號通路中關(guān)鍵基因：髓樣分化因子88(Myeloid Differentiation factor88)的研究，探索家蠶體液免疫的信號傳導(dǎo)的調(diào)控機(jī)制，并取得以下結(jié)果：
　　 1.家蠶BmMyD88基因的克隆及序列分析
　　 基于家蠶基因組數(shù)據(jù)庫，克隆獲得了家蠶BmMyD88基因的cDNA序列，基因全長1188bp，編碼395個(gè)氨基酸，分子量為45kD，等電點(diǎn)為6.

3、54。該蛋白結(jié)構(gòu)上含有兩個(gè)功能區(qū)域：N端的死亡結(jié)構(gòu)域(death domain)，以及C端的TIR結(jié)構(gòu)域(Toll/IL-IR domain，TIR)同源性比對表明，家蠶BmMyD88蛋白與果蠅、埃及伊蚊、人類等，都具有較高的相似性，尤其是在兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域內(nèi)，同源性較高。全基因組基因芯片表明，BmMyD88在家蠶的各個(gè)組織中表達(dá)量均很低，微生物感染后基因芯片也表明，在受到病原侵襲后，BmMyD88表達(dá)也未受誘導(dǎo)發(fā)生變化，維持較低的水平。

4、通過RT-PCR以及熒光定量PCR結(jié)果也進(jìn)一步驗(yàn)證了芯片數(shù)據(jù)。
　　 2.家蠶BmMyD88基因的原核表達(dá)以及多克隆抗體的制備
　　 根據(jù)基因cDNA序列，設(shè)計(jì)引物分別擴(kuò)增了全長和TIR結(jié)構(gòu)域，并且將其分別克隆到pEGX4T-1和pET-28a表達(dá)載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒。將重組后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入Rosetta菌株中，經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)，全長蛋白以上清形式表達(dá)，TIR結(jié)構(gòu)域重組蛋白以包涵體形式表達(dá)，經(jīng)過親和層析，獲得純化的TIR