家蠶特有基因的鑒定、表達(dá)模式分析及功能初探.pdf

1、昆蟲是地球上種類最豐富的動物群體，在生態(tài)系統(tǒng)中占據(jù)重要地位。昆蟲形態(tài)多樣，種類繁多，其物種與形態(tài)的多樣性是在長期進(jìn)化過程中對復(fù)雜的生存環(huán)境逐漸適應(yīng)的結(jié)果。然而，物種的多樣性與生理功能之間存在不可分割的聯(lián)系，換句話說是遺傳物質(zhì)決定了物種的生物學(xué)性狀。隨著越來越多基因組序列的測定，從基因組水平去研究物種特有基因的功能可能會為物種在分化、行為習(xí)性和形態(tài)上區(qū)別于其它生物提供重要線索。
　　 家蠶是典型的鱗翅目模式昆蟲，也是被人類馴化的重

2、要經(jīng)濟(jì)昆蟲。家蠶及更多物種的全基因組序列的測定為我們研究家蠶特有基因提供了平臺。物種特有基因是指與其它物種沒有同源性的可編碼蛋白的基因序列，亦被稱為“孤兒基因”或“ORFans”。對基于家蠶基因組序列的家蠶特有基因乃至鱗翅目特有基因的研究，可以幫助我們了解特有基因在家蠶體內(nèi)行使的特殊功能，還可以幫助我們了解家蠶在馴化過程中導(dǎo)致適應(yīng)性變異產(chǎn)生的機(jī)理，為未知功能基因的研究提供基礎(chǔ)信息。本研究獲得的主要結(jié)果如下：
　　 1.家蠶特有基

3、因的鑒定及序列分析
　　 利用家蠶、蜜蜂、果蠅、按蚊、伊蚊、赤擬谷盜、線蟲、人和原雞等幾個物種的基因組序列及Butterflybase數(shù)據(jù)庫中鱗翅目昆蟲所有報道的基因序列，通過同源序列比對的方法，鑒定了家蠶、蜜蜂、果蠅、按蚊、伊蚊及赤擬谷盜六個昆蟲基因組中的特有基因。在家蠶基因組中，特有基因共有2051個，占所有預(yù)測基因的14％，我們還鑒定出在家蠶基因組中有340個基因為鱗翅目特有基因。蜜蜂、果蠅、按蚊、伊蚊和赤擬谷盜的基因組中

4、分別有特有基因878、2611、1078、1383和4142個；各占了基因組的7.9％、12％、8.2％、8.2％和24.8％。EST數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，在家蠶特有基因和鱗翅目特有基因中，分別有911和227個基因具有EST表達(dá)證據(jù)。結(jié)合家蠶基因功能注釋信息分析表明，有85個家蠶特有基因具有功能注釋信息，鱗翅目特有基因有105個具有功能注釋信息，這些具有功能注釋的基因多是以基因家族形式存在，我們將其功能注釋分為七大類。家蠶特有基因(含鱗翅目特

5、有基因)中有1710個基因是以單拷貝形式存在，其它基因?qū)儆?71個基因家族，如癱瘓肽家族、抗菌肽家族、表皮蛋白等。
　　 2.家蠶特有基因時空及免疫表達(dá)模式分析
　　 基于家蠶全基因組Oligo芯片數(shù)據(jù)，在2391個特有基因中，1535個基因具有對應(yīng)的探針序列。分析這些基因在家蠶五齡3天各組織的表達(dá)情況顯示，有567個基因至少在一個組織中檢測到表達(dá)，其中，組織特異表達(dá)的基因有268個，推測這些基因可能與組織特異的生理途徑

6、相關(guān)；還有63個基因具有組織共表達(dá)特征。在早期胚胎芯片中共檢測到468個基因表達(dá)，在早期胚胎中有近200個基因表達(dá)。對家蠶幼蟲四齡發(fā)育時期芯片分析顯示有623個基因檢測到表達(dá)，有16個基因只在蛻皮期表達(dá)，推測可能與蛻皮過程相關(guān)；還有14個基因僅在食桑期表達(dá)。結(jié)合家蠶變態(tài)發(fā)育時期的芯片數(shù)據(jù)，結(jié)果表明家蠶特有基因中640個基因具有表達(dá)信號，大部分基因在雌雄中具有相似的表達(dá)模式，小部分基因的表達(dá)水平在雌雄中差異較大，推測與精子或卵子的發(fā)生與發(fā)

7、育相關(guān)?；诖竽c桿菌、黑胸敗血、白僵菌和NPV四種微生物誘導(dǎo)的家蠶免疫芯片分析家蠶特有基因的誘導(dǎo)情況，結(jié)果顯示有451個基因具有表達(dá)差異。
　　 3.利用RNAi手段探索候選基因的功能
　　 以具有EST證據(jù)、熟蠶期高量表達(dá)和單拷貝基因為篩選條件，篩選到13個候選基因，利用RNAi干擾實驗初步探討這些基因的功能。表型觀察發(fā)現(xiàn)有6個基因得到了不同的表型改變，多數(shù)基因表現(xiàn)為蛻皮受阻，即無法蛻掉幼蟲的皮。BGIBMGA0007

8、02基因取得較明顯的表型變化，所有處理均可成功蛻皮，但是在RNAi處理后72h左右蛹的身體開始縮短，并逐漸死亡。對干涉?zhèn)€體進(jìn)行解剖發(fā)現(xiàn)，相較于對照而言，處理后的蛹體液含量明顯減少，其它組織沒有明顯變化，推測這個基因可能通過某種特殊的生理途徑影響了蛹的發(fā)育，是蛹發(fā)育過程中的一個必需基因。實時熒光定量PCR顯示該基因進(jìn)行RNAi干涉處理后在mRNA水平表達(dá)下調(diào)，且與dsRNA處理后的雌蛹相比較，其在雄中表達(dá)量下調(diào)更明顯。該基因在發(fā)育時期的R

9、T-PCR表達(dá)譜顯示其在熟蠶期開始表達(dá)上調(diào)且在雄中表達(dá)量較高，而蛹2天組織表達(dá)譜顯示在各組織均有表達(dá)，并在卵巢、精巢和頭中表達(dá)量較高。
　　 4.BGIBMGA000702基因的原核表達(dá)及western blotting檢測
　　 信息分析發(fā)現(xiàn)BGIBMGA000702基因由一個外顯子組成，ORF框為588bp，編碼195個氨基酸，蛋白預(yù)測分子量為23kDa，等電點為9.64，位于1號染色體上。將該基因整個編碼區(qū)序列亞克

10、隆到p28表達(dá)載體上構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到Rosetta(DE3)表達(dá)菌株。通過IPTG誘導(dǎo)重組菌000702/p28/Rosetta(DE3)表達(dá)蛋白，得到一個約25kDa的重組蛋白，其中標(biāo)簽為6×His Tag約為2kD，目的蛋白約23kDa，與預(yù)測分子量相符合。蛋白組分鑒定表明該重組蛋白主要以包涵體形式表達(dá)。利用western blotting檢測該蛋白在發(fā)育過程中的表達(dá)情況顯示其在胚胎、熟蠶階段高量表達(dá)；Western bl

11、otting檢測RNAi干涉后蛋白表達(dá)情況表明該蛋白表達(dá)量明顯下調(diào)，說明瞬時干涉可以引起該基因蛋白水平的表達(dá)下調(diào)。
　　 綜上所述，本文鑒定了家蠶、果蠅等六個昆蟲基因組中特有基因及鱗翅目昆蟲特有基因，并詳細(xì)分析了家蠶和鱗翅目特有基因的序列信息及時空和免疫芯片表達(dá)譜，最后利用RNAi干擾實驗和原核表達(dá)及western blotting初步探索了BGIBMGA000702基因的功能。本研究鑒定的家蠶特有基因?qū)榧倚Q特有的生理過程及生