GLP-1對(duì)骨骼肌肌球蛋白重鏈表達(dá)的影響及機(jī)制研究.pdf

1、胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)是由小腸L細(xì)胞分泌的肽類激素，在進(jìn)入腸道的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)刺激下分泌.研究表明GLP-1能夠促進(jìn)胰島素的分泌，提高外周組織對(duì)糖的吸收和利用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，GLP-1短期處理能促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞的糖吸收；發(fā)育早期GLP-1處理能夠程序化地影響糖尿病模型鼠成年后的血糖及糖耐受力。鑒于骨骼肌纖維類型與機(jī)體葡萄糖利用和糖尿病發(fā)生關(guān)系密切，我們假設(shè)發(fā)育早期GLP-1處理會(huì)通過改變肌球蛋白重鏈表達(dá)而改變肌纖維類型，從而程序化地改變

2、成年后肌肉代謝類型。本研究通過在體的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證這一假說。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以大鼠為模型，將構(gòu)建的分泌型GLP-1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染新生大鼠肌肉，研究新生期GLP-1高豐度表達(dá)對(duì)肌肉肌球蛋白重鏈及其相關(guān)基因表達(dá)的程序化影響；體外實(shí)驗(yàn)以胰島素耐受的小鼠成肌細(xì)胞系C2C12細(xì)胞為模型，在培養(yǎng)基中添加GLP-1受體的擬似物Exendin4和Exendin9，觀察肌球蛋白重鏈及其相關(guān)基因表達(dá)的變化，并探討兩種擬似物之間的相互關(guān)系及作用途徑。

3、r>　　 1新生期肌肉轉(zhuǎn)染分泌型GLP-1表達(dá)質(zhì)粒對(duì)大鼠生長(zhǎng)和肌肉肌球蛋白重鏈及其相關(guān)基因表達(dá)的程序化影響
　　 將帶有信號(hào)肽片段的GLP-1 cDNA裝入載體質(zhì)粒pcDNA3中，構(gòu)建分泌型的GLP-1，命名為sig-glp-1-pcDNA3。新生Wistar雄性大鼠稱重后隨機(jī)分為3組，2日齡在左側(cè)后肢腓腸肌進(jìn)行分點(diǎn)肌肉注射：空質(zhì)粒組(VP)即對(duì)照組注射含120μg空載pcDNA3的PBS溶液120μL，低劑量組(LG)注射含

4、60μg sig-glp-1-pcDNA3重組質(zhì)粒的PBS溶液120μL，高劑量組(HG)給與含120μg sig-glp-1-pcDNA3重組質(zhì)粒的PBS溶液120μL，隨后進(jìn)行電刺激實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后7日采集注射部位肌肉檢測(cè)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染表達(dá)情況，其余動(dòng)物正常飼養(yǎng)至8周齡，記錄動(dòng)物生長(zhǎng)情況。八周齡時(shí)采集血清及比目魚肌、腓腸肌組織樣品，分析血清激素水平、肌肉形態(tài)和相關(guān)基因表達(dá)的變化。結(jié)果顯示：(1)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染7日后注射部位肌肉中可以檢測(cè)到G

5、LP-1 mRNA的表達(dá)，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確，轉(zhuǎn)染成功；(2)低劑量重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染造成大鼠的生長(zhǎng)初期增重顯著下降，高劑量組大鼠體重也有下降的趨勢(shì)；(3)兩個(gè)處理組大鼠血清胰島素水平均顯著下降，高劑量組大鼠血清中的T3水平也顯著下降，但糖耐量并未見顯著變化；(4)比目魚肌和腓腸肌重量、肌肉中糖原含量，以及經(jīng)ATPase染色鑒定的Ⅰ型纖維數(shù)目占肌纖維總數(shù)的比例均無顯著差異；而腓腸肌乳酸含量在兩個(gè)處理組均顯著降低，比目魚肌乳酸含量在高劑量組顯

6、著下調(diào)，低劑量組有下調(diào)的趨勢(shì)；(5)SDS-PAGE顯示低劑量組大鼠腓腸肌肌球蛋白重鏈的組成發(fā)生由快向慢的轉(zhuǎn)化；而比目魚肌主要表現(xiàn)為氧化代謝的重要基因PGC-1α和糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體4(GLUT4)的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)。結(jié)論：新生期GLP-1適當(dāng)?shù)母弑磉_(dá)會(huì)輕度的導(dǎo)致大鼠生長(zhǎng)阻滯，在糖耐量維持正常的情況下伴隨胰島素水平顯著下降；同時(shí)骨骼肌糖代謝向有利于糖的吸收和氧化代謝的方向發(fā)展，從而更有利于機(jī)體糖穩(wěn)態(tài)的維持.
　　 2、 GLP-1擬

7、似物對(duì)肌管細(xì)胞糖吸收、肌球蛋白重鏈和相關(guān)基因表達(dá)的影響及機(jī)制
　　 小鼠成肌細(xì)胞系C2C12經(jīng)培養(yǎng)并誘導(dǎo)分化后，在培養(yǎng)液中分別加入10-9 mol/LExendin4(Ex4)、10-9 mol/L Exendin9(Ex9)和10-9 mol/L Ex4＋10-9 mol/L Ex9，每24 h換液，處理72 h。分別收集各組細(xì)胞上清液測(cè)定上清液中葡萄糖的含量?？椎踪N壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用于測(cè)定細(xì)胞糖吸收和相關(guān)基因表達(dá)情況。結(jié)果顯示：

8、(1) Ex4和Ex9分別處理并不顯著影響基礎(chǔ)狀態(tài)下細(xì)胞的糖吸收，但Ex9處理顯著增強(qiáng)胰島素刺激下的糖吸收。Ex4和Ex9復(fù)合處理導(dǎo)致基礎(chǔ)狀態(tài)下細(xì)胞糖吸收顯著增強(qiáng)，但胰島素刺激下的糖吸收無顯著變化。無論單獨(dú)處理，還是復(fù)合處理均沒有改變細(xì)胞培養(yǎng)液中的葡萄糖濃度；(2)肌球蛋白重鏈主要的四種亞型(I,2A，2X,2B)在肌管細(xì)胞中均有表達(dá)。Ex9導(dǎo)致MyHC I和MyHC2A mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，MyHC I型蛋白占MyHC蛋白總量的比例

9、顯著上調(diào)，同時(shí)MyHCⅡ型蛋白的總量與對(duì)照組相比也出現(xiàn)顯著上調(diào)；相反，Ex4單獨(dú)處理或與Ex9復(fù)合處理均導(dǎo)致MyHC2A mRNA的表達(dá)顯著下調(diào)，MyHC I型蛋白比例顯著下降，而MyHCⅡ型的蛋白總量無顯著變化。(3)各組GLUT4mRNA表達(dá)均沒有顯著差異，而PGC-1α mRNA表達(dá)在Ex9組顯著上調(diào)，Ex4組和Ex4＋Ex9組顯著下調(diào)，PDK4 mRNA表達(dá)只在Ex4+Ex9組出現(xiàn)顯著的下調(diào)；蛋白水平的差異與mRNA水平基本吻合

10、，各組細(xì)胞GLUT4蛋白含量也無顯著差異，Ex9組PGC-1α蛋白水平顯著上調(diào)，不過Ex4組和Ex4＋Ex9組PGC-1α水平未檢測(cè)到顯著變化。結(jié)論：Ex9能夠增強(qiáng)C2C12肌管的胰島素敏感性，能夠促進(jìn)細(xì)胞MyHC I和PGC-1α表達(dá)；Ex4不影響肌管細(xì)胞糖吸收，但抑制PGC-1α表達(dá)的同時(shí)對(duì)慢型肌球蛋白重鏈MyHC I和MyHC2A表達(dá)有不同程度上的抑制；Ex4和Ex9對(duì)肌管細(xì)胞的糖吸收，肌球蛋白重鏈表達(dá)和代謝相關(guān)基因表達(dá)的作用大致

11、呈相反趨勢(shì)，Ex4與Ex9復(fù)合處理時(shí)主要表現(xiàn)Ex4的作用，而不表現(xiàn)相互拮抗.
　　 采用表達(dá)譜基因芯片篩選Ex4, Ex9以及兩者復(fù)合處理導(dǎo)致的差異表達(dá)基因，并對(duì)可能的作用途徑進(jìn)行初步探討。結(jié)果表明：(1) Ex9處理后的差異表達(dá)基因以上調(diào)為主，其中包括了涉及Ca2+通路的基因鉀離子電壓門控通道（K+voltage-gated channel）和Calumenin，提示Ex9的作用可能與鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān).(2) Ex4單獨(dú)

12、處理和Ex4+Ex9共同處理時(shí)的差異表達(dá)基因以下調(diào)為主，其中包括肌細(xì)胞的骨架蛋白Neblin和Titin，此外兩組同時(shí)都上調(diào)了DNA fragmentation factor，推測(cè)細(xì)胞凋亡過程可能參與了Ex4的作用途徑。(3)進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比各處理組均沒有檢測(cè)到Casepase3/7活性的變化，三個(gè)處理組細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度較對(duì)照組均顯著上升，但細(xì)胞內(nèi)CalcineurinA的含量只有Ex9處理組顯著上調(diào)。結(jié)論：Ex9可以