GLP-1對巨噬細胞極化的影響及機制研究.pdf

1、目的：
　　胰島素抵抗與體內慢性炎癥密切相關，巨噬細胞向M1(促炎表型)或M2(抗炎表型)極化直接影響體內炎癥狀態(tài)。GLP-1作用于巨噬細胞，能激活STAT3、增加M2極化及抗炎因子的分泌，減少M1極化及抑制炎癥反應。本研究通過培養(yǎng)小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7并運用GLP-1等藥物干預，探索GLP-1對巨噬細胞極化的影響及與cAMP/PKA、JNK、STAT3之間的調控關系，對巨噬細胞極化的分子調控機制以及與胰島素抵抗之間的

2、關系作深入探討，以發(fā)現(xiàn)其改善炎癥、緩解胰島素抵抗的機制及相關藥物靶點。
　　方法:
　　將RAW264.7細胞接種于六孔板中，待貼壁后棄掉舊培養(yǎng)基，用無血清的DMEM高糖培養(yǎng)基饑餓過夜使細胞生長同步化后在有或無GLP-1干預下培養(yǎng)24h，加LPS(100ng/ml)或IL-4(10ng/ml)刺激24h誘導極化，并且在GLP-1干預之前相應的用JNK抑制劑SP600125(10μM)，腺苷酸環(huán)化酶激活劑Forskolin(1

3、0μM)或PKA抑制劑H89(10μM)預先孵育30min，用Western blot檢測RAW264.7細胞中cAMP/PKA、JNK、STAT3之間的上下游調控關系，RealTime熒光定量PCR檢測M1/M2特異性基因的表達，酶免疫分析法(EIA法)測RAW264.7細胞內cAMP的水平。
　　結果：
　　與Control組相比，GLP-1對RAW264.7細胞中STAT3(Tyr705)磷酸化水平在一定范圍內呈現(xiàn)濃度

4、依賴性增高(p<0.05)，10nM GLP-1干預組中細胞內STAT3磷酸化水平較其他各濃度干預組增高(p<0.05)，GLP-1干預組細胞總STAT3水平無差異。相比于Control組，10nM GLP-1組增加了M2特異性基因(IL-10,MRC-1,ARG-1)的表達(p<0.05)，明顯降低M1特異性基因(IL-6,TNF-α,iNOS)的表達(p<0.05)，GLP-1預處理明顯降低了LPS誘導的RAW264.7細胞中IL-

5、6、TNF-α、iNOS基因表達(p<0.05)。
　　相比于Control組，GLP-1組、IL-4組STAT3磷酸化水平上升(p<0.05)，GLP-1組的JNK(Thr183/Tyr185)磷酸化水平下降了43％(p<0.05)，而總的JNK蛋白水平無明顯差異，SP600125干預組抑制了JNK磷酸化水平(p<0.05)，之后STAT3磷酸化水平反而增加了0.88倍(p<0.05)；GLP-1預處理相應的增加了LPS和IL-

6、4組STAT3磷酸化水平(p<0.05)。相比于LPS組，SP600125預處理呈現(xiàn)出對JNK磷酸化水平的抑制作用(p<0.05)，反而增加了STAT3磷酸化水平(p<0.05)。
　　與Control組相比，各濃度GLP-1干預組均可增加RAW264.7巨噬細胞內cAMP含量，呈濃度遞增性并以10nM組最為明顯(p<0.05)。與Control組相比，GLP-1、Forskolin處理組均減少了JNK磷酸化水平，而H89干預組增

7、加了JNK磷酸化水平，差異均有統(tǒng)計學意義，而各干預組細胞中總JNK蛋白水平無統(tǒng)計學差異；與GLP-1組相比，H89預處理組增加了JNK磷酸化水平，即H89的干預阻斷了GLP-1對JNK磷酸化水平的抑制作用(p<0.05)。與GLP-1組相比，F(xiàn)orskolin干預后明顯增加M2相關基因表達，而H89干預后減少了M2相關基因表達(p<0.05)；與 LPS組比較，GLP-1、Forskolin預處理組均減少了M1相關炎癥基因的表達，H89

8、預處理組反而增加了M1相關炎癥基因的表達(p<0.05)，GLP-1對炎癥因子的抑制作用，H89干預后逆轉了此作用(p<0.05)。
　　結論：
　　GLP-1通過增加RAW264.7細胞中磷酸化STAT3的水平而發(fā)揮促進M2極化作用，GLP-1能夠抑制巨噬細胞內JNK磷酸化而抑制M1極化；RAW264.7細胞磷酸化JNK對細胞內磷酸化STAT3發(fā)揮負性調控作用，JNK-STAT3通路共同調控巨噬細胞M1/M2極化的平衡；G