草魚骨骼肌肌球蛋白重鏈同工型基因的cDNA克隆與表達.pdf

1、在魚類肌肉蛋白質中，肌球蛋白占肌原纖維蛋白質的50％以上。它是一種普通的真核細胞運動性蛋白，能和肌動蛋白結合形成細胞運動如胞質分裂和肌肉收縮等所需的物質。普通的肌球蛋白一般由兩條重鏈亞基(MHC)和兩對不對稱的輕鏈亞基構成，而MHC具有肌球蛋白分子運動馬達和細絲形成的作用，可以分為兩個功能性結構域：氨基端具有馬達功能的頭部球狀區(qū)域和羧基端具有絲狀形成能力的一個具有α雙螺旋長桿狀結構域。而ATPase酶解和肌動蛋白結合位點都位于重鏈頭部區(qū)

2、域Subfragment-1(S1)部位的兩個表面環(huán)附近。草魚屬于廣溫性的淡水魚類，它的肌肉功能伴隨棲息水溫的變化而變化，以至于能夠周年生活在溫差極大的棲息環(huán)境中。淡水魚所具有的這種獨特的溫度適應能力與其肌原纖維蛋白質主要是肌球蛋白性質的季節(jié)變化是密切相關的，而肌球蛋白的熱穩(wěn)定性通常會影響魚類肌肉的加工適性。因此本實驗選取草魚作為研究對象，分離和克隆骨骼肌MHC的三種同工型基因，同時通過半定量PCR法初步了解這三種同工型基因伴隨溫度變化

3、的表達模式，并利用同源建模法對草魚MHC三維立體結構進行了預測。 1.本研究以自然條件下四個季節(jié)的草魚為材料，提取骨骼肌總RNA，通過運用逆轉錄PCR并結合RACE法等，成功地獲得草魚三種MHC同工型基因的全長序列。經核苷酸序列分析，10-type cDNA的全長序列為5968bp，編碼區(qū)域核苷酸長度為5790bp；I-type cDNA的全長序列為5957bp，編碼區(qū)域核苷酸長度為5799bp；30-type cDNA的序列長

4、度為5898bp，編碼區(qū)域長度為5802bp。經NCBIblast分析后發(fā)現與鯉科魚類肌球蛋白序列具有很高的同源性，因此認為本實驗獲得了草魚骨骼肌肌球蛋白重鏈三種同工型基因的全長序列。 2.這三種同工型基因分別編碼了1930、1933、1934個氨基酸序列。與鯉魚，兔子等其他哺乳動物的氨基酸序列進行比對分析，1O-type和I-type相似性為87.6％，和30-type的相似性為86.7％，而I-type和30-type的相似

5、性達到了97.5％。另外這三種同工型氨基酸序列跟兔子的MHC全長cDNA比較，相似性分別是80.3％，82.5％，81.9％。10-type氨基酸序列之所以呈現出與其他同工型這些差異，主要是因為全長氨基酸序列共有145個變異位點，約占7.51％，其中S1就占到了97個。同時實驗還對MHC中的兩個重要區(qū)域S1和LMM進行初級結構的分析，結果表明：S1區(qū)域中的兩個表面環(huán)Loop1和I．oop2氨基酸序列的差異引起草魚肌球蛋白ATPase的熱

6、穩(wěn)定性變化；而LMM區(qū)域的28-殘基重復排列模式分析圖差異也證明了30-type LMM能夠形成更為穩(wěn)定的α-雙螺旋結構。與其他哺乳動物做了個系統(tǒng)發(fā)育樹分析，結果表明了草魚和鯉魚MHC的多基因家族與哺乳動物的骨骼肌MHC更具有親緣關系。 3.同樣以自然條件下四個季節(jié)的草魚為材料，提取骨骼肌總RNA，采用了半定量RT-PCR方法檢測不同季節(jié)草魚骨骼肌中這三種MHC同工型基因mRNA的變化時發(fā)現，冬季草魚大部分表達的是10-type