草魚(yú)骨骼肌肌球蛋白重鏈同工型基因的cDNA克隆與表達(dá).pdf

1、在魚(yú)類肌肉蛋白質(zhì)中，肌球蛋白占肌原纖維蛋白質(zhì)的50％以上。它是一種普通的真核細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性蛋白，能和肌動(dòng)蛋白結(jié)合形成細(xì)胞運(yùn)動(dòng)如胞質(zhì)分裂和肌肉收縮等所需的物質(zhì)。普通的肌球蛋白一般由兩條重鏈亞基(MHC)和兩對(duì)不對(duì)稱的輕鏈亞基構(gòu)成，而MHC具有肌球蛋白分子運(yùn)動(dòng)馬達(dá)和細(xì)絲形成的作用，可以分為兩個(gè)功能性結(jié)構(gòu)域：氨基端具有馬達(dá)功能的頭部球狀區(qū)域和羧基端具有絲狀形成能力的一個(gè)具有α雙螺旋長(zhǎng)桿狀結(jié)構(gòu)域。而ATPase酶解和肌動(dòng)蛋白結(jié)合位點(diǎn)都位于重鏈頭部區(qū)

2、域Subfragment-1(S1)部位的兩個(gè)表面環(huán)附近。草魚(yú)屬于廣溫性的淡水魚(yú)類，它的肌肉功能伴隨棲息水溫的變化而變化，以至于能夠周年生活在溫差極大的棲息環(huán)境中。淡水魚(yú)所具有的這種獨(dú)特的溫度適應(yīng)能力與其肌原纖維蛋白質(zhì)主要是肌球蛋白性質(zhì)的季節(jié)變化是密切相關(guān)的，而肌球蛋白的熱穩(wěn)定性通常會(huì)影響魚(yú)類肌肉的加工適性。因此本實(shí)驗(yàn)選取草魚(yú)作為研究對(duì)象，分離和克隆骨骼肌MHC的三種同工型基因，同時(shí)通過(guò)半定量PCR法初步了解這三種同工型基因伴隨溫度變化

3、的表達(dá)模式，并利用同源建模法對(duì)草魚(yú)MHC三維立體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)。 1.本研究以自然條件下四個(gè)季節(jié)的草魚(yú)為材料，提取骨骼肌總RNA，通過(guò)運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄PCR并結(jié)合RACE法等，成功地獲得草魚(yú)三種MHC同工型基因的全長(zhǎng)序列。經(jīng)核苷酸序列分析，10-type cDNA的全長(zhǎng)序列為5968bp，編碼區(qū)域核苷酸長(zhǎng)度為5790bp；I-type cDNA的全長(zhǎng)序列為5957bp，編碼區(qū)域核苷酸長(zhǎng)度為5799bp；30-type cDNA的序列長(zhǎng)

4、度為5898bp，編碼區(qū)域長(zhǎng)度為5802bp。經(jīng)NCBIblast分析后發(fā)現(xiàn)與鯉科魚(yú)類肌球蛋白序列具有很高的同源性，因此認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)獲得了草魚(yú)骨骼肌肌球蛋白重鏈三種同工型基因的全長(zhǎng)序列。 2.這三種同工型基因分別編碼了1930、1933、1934個(gè)氨基酸序列。與鯉魚(yú)，兔子等其他哺乳動(dòng)物的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，1O-type和I-type相似性為87.6％，和30-type的相似性為86.7％，而I-type和30-type的相似

5、性達(dá)到了97.5％。另外這三種同工型氨基酸序列跟兔子的MHC全長(zhǎng)cDNA比較，相似性分別是80.3％，82.5％，81.9％。10-type氨基酸序列之所以呈現(xiàn)出與其他同工型這些差異，主要是因?yàn)槿L(zhǎng)氨基酸序列共有145個(gè)變異位點(diǎn)，約占7.51％，其中S1就占到了97個(gè)。同時(shí)實(shí)驗(yàn)還對(duì)MHC中的兩個(gè)重要區(qū)域S1和LMM進(jìn)行初級(jí)結(jié)構(gòu)的分析，結(jié)果表明：S1區(qū)域中的兩個(gè)表面環(huán)Loop1和I．oop2氨基酸序列的差異引起草魚(yú)肌球蛋白ATPase的熱

6、穩(wěn)定性變化；而LMM區(qū)域的28-殘基重復(fù)排列模式分析圖差異也證明了30-type LMM能夠形成更為穩(wěn)定的α-雙螺旋結(jié)構(gòu)。與其他哺乳動(dòng)物做了個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，結(jié)果表明了草魚(yú)和鯉魚(yú)MHC的多基因家族與哺乳動(dòng)物的骨骼肌MHC更具有親緣關(guān)系。 3.同樣以自然條件下四個(gè)季節(jié)的草魚(yú)為材料，提取骨骼肌總RNA，采用了半定量RT-PCR方法檢測(cè)不同季節(jié)草魚(yú)骨骼肌中這三種MHC同工型基因mRNA的變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，冬季草魚(yú)大部分表達(dá)的是10-type