家蠶BmMet基因的鑒定、克隆及功能分析.pdf

1、在昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)、變態(tài)和生殖等發(fā)育過(guò)程中，蛻皮激素(Molting hormone，MH)和保幼激素(Juvenile hormone，JH)發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。目前，MH調(diào)控昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制已經(jīng)比較清楚，參與MH信號(hào)傳導(dǎo)的受體和其他級(jí)聯(lián)調(diào)控因子相繼被鑒定，并建立了MH的級(jí)聯(lián)信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。而有關(guān)JH的分子作用機(jī)制的研究報(bào)道則相對(duì)較少，參與JH信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)控基因至今還未被確定。 Methoprene-tolerant(M

2、et)基因最早在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，編碼一個(gè)bHLH-PAS型轉(zhuǎn)錄因子，具有典型的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。已有研究報(bào)道，DmMet可以與JH主要種類即JHIII特異性結(jié)合并具有很高的親和力，其突變體對(duì)JH產(chǎn)生抗性，過(guò)量表達(dá)DmMet則會(huì)增加果蠅對(duì)外源JH的敏感性，且能導(dǎo)致果蠅在幼蟲(chóng)期和蛹期死亡。另外，通過(guò)RNAi的方式將赤擬谷盜TcMet基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄沉默后，不僅使赤擬谷盜產(chǎn)生了對(duì)JH的抗性，而且還引起了幼蟲(chóng)的早熟變態(tài)。表明Met基因在JH的調(diào)控過(guò)程

3、中起了重要的作用，并由此推測(cè)Met可能是JH的候選受體。 家蠶是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)和鱗翅目模式生物。近年來(lái)，研究者在家蠶發(fā)育的激素調(diào)控機(jī)理研究等方面，取得了諸多突破性進(jìn)展。本研究基于家蠶基因組精細(xì)圖、家蠶全基因組芯片表達(dá)數(shù)據(jù)、RACE技術(shù)和RNAi技術(shù)對(duì)家蠶可能的JH受體BmMet基因進(jìn)行了全長(zhǎng)cDNA克隆和基因干涉實(shí)驗(yàn)，初步探討了BmMet基因的功能。獲得的主要研究結(jié)果如下： 1.家蠶BmMet基因的全長(zhǎng)cDNA克隆

4、 通過(guò)生物信息學(xué)分析，我們?cè)诩倚Q基因組精細(xì)圖預(yù)測(cè)基因中鑒定了一個(gè)與果蠅DmMet基因有較高相似性的基因，并命名為BmMet。采用RACE-PCR的方法克隆獲得了該基因的全長(zhǎng)cDNA序列。BmMet基因cDNA全長(zhǎng)為1917 bp，其中ORF有1368bp，編碼455個(gè)氨基酸。5'-UTR核苷酸為405bp，3'-UTR核苷酸為144bp，并包含一個(gè)32bp的poly(A)尾巴。 2.家蠶BmMet基因的序列結(jié)構(gòu) 通過(guò)染

5、色體定位和基因組比較分析發(fā)現(xiàn)，該基因位于家蠶第8號(hào)染色體上，整個(gè)基因只有1個(gè)外顯子，沒(méi)有內(nèi)含子，這與其他昆蟲(chóng)Met基因中的內(nèi)含子數(shù)目不同，如黑腹果蠅中存在1個(gè)內(nèi)含子、埃及伊蚊9個(gè)、<比亞按蚊7個(gè)、赤擬谷盜7個(gè)。通過(guò)在線SMART程序結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示，家蠶BmMet含有與其他昆蟲(chóng)Met一致的結(jié)構(gòu)域，即bHLH、PAS-A、PAS-B和PAC，推測(cè)BmMet基因可能有與其他昆蟲(chóng)Met基因相類似的功能。 3.家蠶BmMet基因的時(shí)空表達(dá)

6、特征 采用RT-PCR技術(shù)，我們分析了BmMet基因在家蠶不同發(fā)育時(shí)期個(gè)體和幼蟲(chóng)5齡第3天不同組織器官中的表達(dá)特征。結(jié)果表明，BmMet基因在家蠶整個(gè)發(fā)育時(shí)期都有持續(xù)的表達(dá)，在幼蟲(chóng)5齡第3天的各個(gè)組織器官中也都有表達(dá)，這與家蠶體內(nèi)JH滴度的有規(guī)律變化沒(méi)有明顯相關(guān)性，推測(cè)BmMet基因的表達(dá)并沒(méi)有受到JH的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)。 4.家蠶BmMet基因功能的RNAi分析 通過(guò)dsRNA介導(dǎo)的RNAi實(shí)驗(yàn)，我們對(duì)家蠶BmMet基

7、因的功能進(jìn)行了初探。在幼蟲(chóng)4齡起蠶將BmMet基因轉(zhuǎn)錄沉默后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，并沒(méi)有影響家蠶的正常發(fā)育，家蠶可以正常地蛻去4齡舊表皮而進(jìn)入5齡，并正常地化蛹、化蛾。這與赤擬谷盜中TcMet基因的干涉效果不同，而與果蠅中DmMet基因缺失后無(wú)明顯表型相類似，暗示Met基因在家蠶和果蠅中與其在赤擬谷盜中的作用方式不同。 綜上所述，本研究在家蠶基因組中鑒定并克隆了Met基因的全長(zhǎng)cDNA序列，發(fā)現(xiàn)家蠶BmMet基因同其他昆蟲(chóng)Met基因在序列