果梅PmARF基因的克隆及功能分析.pdf

1、果梅(Prunus mume Sieb.et Zucc.)原產(chǎn)于中國，為薔薇科李屬植物。梅花具很高的觀賞價(jià)值，梅果實(shí)營養(yǎng)豐富。果梅中雌蕊敗育現(xiàn)象嚴(yán)重，并且嚴(yán)重影響果梅產(chǎn)量。本研究通過生物信息學(xué)方法鑒定和識(shí)別了梅基因組中ARF基因家族，并通過熒光定量PCR技術(shù)，初步探究ARF基因家族在果梅花芽雌蕊發(fā)育形態(tài)中的影響作用，進(jìn)而利用國家果梅種質(zhì)資源圃杲梅品種‘大嵌蒂’為試材，通過RT-PCR技術(shù)，分離克隆了果梅PmARF11基因。將PmARF1

2、1基因轉(zhuǎn)化模式植物煙草對(duì)其功能進(jìn)行初步鑒定。主要研究結(jié)果如下:
　　1梅PmARF基因家族的識(shí)別和鑒定。植物生長和發(fā)育的各個(gè)生理過程都受到生長素的影響，尤其是對(duì)花器官的發(fā)育過程，生長素影響作用更為顯著。植物ARF轉(zhuǎn)錄因子是生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要調(diào)控因子。盡管ARF基因家族已經(jīng)在很多物種中被研究，但有關(guān)果梅ARF基因家族的信息還很少。本論文著重分析了梅基因組中ARF基因家族，包括染色體定位，進(jìn)化樹分析，基因結(jié)構(gòu)，蛋白結(jié)構(gòu)以及亞細(xì)

3、胞定位預(yù)測的分析。研究結(jié)果顯示，在果梅基因組中，共鑒定出17個(gè)PmARF基因成員，并根據(jù)ARF基因家族的系統(tǒng)發(fā)育和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，將其分為6大類。此外，為了進(jìn)一步探究生長素在植物花發(fā)育過程中分子機(jī)制，特別是PmARF基因?qū)Υ迫锇l(fā)育的調(diào)控機(jī)理，本文通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)果梅品種‘大嵌蒂’的完全花芽和不完全花芽進(jìn)行了部分PmARF基因的表達(dá)分析。研究結(jié)果初步闡明了PmARF11基因與果梅雌蕊發(fā)育之間有著密切聯(lián)系，并為在木本植物中進(jìn)一步的探

4、索ARF轉(zhuǎn)錄因子家族鑒定了基礎(chǔ)。
　　2果梅PmARF11基因克隆及生物信息學(xué)分析。利用RT-PCR方法在從果梅品種‘大嵌蒂’的早期花芽中分離克隆PmARF11，為研究果梅雌蕊發(fā)育的分子機(jī)理鑒定基礎(chǔ)。根據(jù)梅基因組注釋蛋白Pm019941設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR技術(shù)克隆PmARF11基因。通過生物信息學(xué)的方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)功能分析，分析結(jié)果顯示:PmARF11基因cDNA編碼區(qū)全長為2136bp，編碼711aa，預(yù)測的分子量為78.66

5、3kDa，理論等電點(diǎn)為5.80。亞細(xì)胞定位預(yù)測推斷PmARF11基因編碼蛋白定位于細(xì)胞核。
　　3果梅PmARF11基因的功能分析。在植物中，ARF轉(zhuǎn)錄因子是生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的一類重要轉(zhuǎn)錄因子。本研究從果梅品種‘大嵌蒂’中克隆獲得一條ARF基因相關(guān)cDNA序列，命名為PmARF11。成功構(gòu)建了PmARF11基因的植物表達(dá)載體，將構(gòu)建好的PBI121-PmARF11載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草，獲得煙草抗性植株。獲得的抗

6、性植株經(jīng)過GUS、PCR、RT-PCR檢測驗(yàn)證，初步證實(shí)獲得3個(gè)轉(zhuǎn)PmARF基因煙草株系。對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草株系與野生型煙草株系進(jìn)行培養(yǎng)觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn):在相同培養(yǎng)條件下，轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草相比，葉片衰老速度加快和植株的生長周期明顯延長，轉(zhuǎn)基因植株煙草花與野生型相比其花器官具有一定差異，具體表現(xiàn)為，轉(zhuǎn)基因植株花瓣深裂，顏色較深，開花期明顯延長，轉(zhuǎn)基因雌蕊較野生型雌蕊稍長，表明轉(zhuǎn)PmARF11基因不僅參與花器官的形態(tài)建成，還能夠誘導(dǎo)葉片衰老和