海南花梨木dna條形碼序列測定-畢業(yè)論文

1、<p>　　畢 業(yè) 論 文（設(shè)計）</p><p>　　題 目：海南花梨木DNA條形碼序列測定 </p><p>　　學 號： </p><p>　　姓 名： </p>

2、<p>　　年 級： </p><p>　　學 院： </p><p>　　系 別： </p><p>　　專 業(yè)： </p&

3、gt;<p>　　指導教師： </p><p><b>　　完成日期： </b></p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　DNA條形碼作為生命體所固有的遺傳物質(zhì)，客觀存在于細胞內(nèi)的物質(zhì)，不受人為因素干擾，能準確的反映出物種最基本的信息。</p>

4、<p>　　為了驗證國際生命條形碼聯(lián)盟推薦的MatK，trnH-psbA，ITS2三個候選條形碼，在珍貴木材降香黃檀(Dalbergia odorifera T. Chen)又名花梨木DNA條形碼測定中的有效性。從基地采摘的降香黃檀葉片中提取DNA，用特異性引物進行PCR擴增，得到三條候選條形碼的目的片段，擴增成功的DNA片段可用于進一步測序分析。以PCR擴增成功率和測序成功率初步評價候選DNA條形碼片段，評選出最優(yōu)的條形碼片

5、段，為今后利用DNA條形碼鑒定木材和構(gòu)建木材分子條形碼數(shù)據(jù)庫提供理論依據(jù)。</p><p>　　實驗結(jié)果：只有ITS2的條形碼片段測序成功，得到對應(yīng)的序列。通過NCBI查詢黃檀屬其他物種的ITS2序列，得到：降香黃檀的ITS2分子序列與黃檀屬植物均不同，其中與越南黃檀差異最小，其次是多裂黃檀。多重比對后構(gòu)建該序列的進化樹結(jié)果說明降香黃檀與越南黃檀、多裂黃檀有著較近的親緣關(guān)系，但又不屬于同一植物類群，且三者有著穩(wěn)定

6、的遺傳差異性。建議把ITS2序列作為鑒定降香黃檀的候選條形碼序列。</p><p>　　關(guān)鍵詞：降香黃檀；DNA條形碼；ITS2；分子鑒定</p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　DNA barcode as the genetic materialin life inherent that objective

7、ly existed in the cell, without artificial interference. It could accurately reflect the most essential information for species. </p><p>　　In order to verify three candidate barcodes of the MatK, trnH – psbA

8、 and ITS2 recommended by CBOL and the effectiveness in Dalbergia odorifera ’s DNA barcode. Extracted DNA of its leaves from the base,using specific primers for PCR amplication. The purpose of the three candidates from ba

9、r code fragments were obtained and the targeted segment was amplified successfully to be used for sequencing analysis. PCR amplification and sequencing success rate could be used for the preliminary evaluation th</p&g

10、t;<p>　　The results were as follows : only ITS2 coded fragment was successfully sequenced. and the corresponding sequence was gained. By searched ITS2 of other species which belong to Dalbergia from NCBI. We got t

11、he consion conclusion that: ITS2 of Dalbergia odorifera were different,with Dalbergia tonkinensis minimum, followed by Dalbergia rimosa Multiple comparison after building the sequence of the evolutionary tree result show

12、ed that Dalbergia odorifera Dalbergia tonkinensis and Dalbergia rimosa had</p><p>　　Keywords:Dalbergia odorifera T.Chen; DNA barcoding; ITS2; molecular identification</p><p><b>　　目 錄&l

13、t;/b></p><p><b>　　1 前言1</b></p><p>　　1.1分子條形碼序列測定及其在木材應(yīng)用方面的研究進展1</p><p>　　1.2研究的目的與意義2</p><p><b>　　2 材料與方法3</b></p><p><b

14、>　　2.1材料3</b></p><p><b>　　2.2試劑藥品3</b></p><p>　　2.3主要儀器設(shè)備3</p><p>　　2.4 實驗步驟3</p><p>　　2.4.1條形碼片段的 PCR 擴增3</p><p>　　2.4.2 條形碼片段的純

15、化與檢測5</p><p><b>　　2.4.3克隆6</b></p><p>　　2.4.4 測序7</p><p><b>　　3結(jié)果與分析7</b></p><p>　　3.1條形碼片段 PCR 擴增結(jié)果7</p><p>　　3.2條形碼片段測序結(jié)果8&

16、lt;/p><p>　　3.3序列分析10</p><p><b>　　4結(jié)論與討論11</b></p><p><b>　　4.1結(jié)論11</b></p><p><b>　　4.2討論11</b></p><p><b>　　致謝13

17、</b></p><p><b>　　參考文獻14</b></p><p><b>　　1 前言</b></p><p>　　降香黃檀(Dalbergia odorifera T. Chen.)又名花梨木為黃檀屬植物,異花授粉，翅果，主要靠種子繁殖。以其枝干、根、心材干燥后入藥，具行氣活血、止血、止痢功效，是

18、國家藥典收載名貴南藥之一。現(xiàn)代研究還發(fā)現(xiàn)降香黃檀具有抗氧化[1]、抑制中樞[2]等的作用[3]。降香黃檀心材極耐腐，切面光亮，且香氣經(jīng)久不滅，可用于高檔家具、工藝品等。</p><p>　　野生的降香黃檀大多分布于我國海南省中部和南部，且多生于中海拔地區(qū)[4]，一般成片生長，形成了以降香黃檀為上層樹種的植物群落類型[5]。品種的種質(zhì)背景復雜和由各居群所處地理位置不同而產(chǎn)生的水熱條件差異，都是降香黃檀具有豐富遺傳多

19、樣性的影響因素。</p><p>　　降香黃檀生長較為緩慢，從種植到心材出現(xiàn)需要多年的時間，近年來其野生資源已遭毀滅性的破壞，瀕于滅絕急需保護[6]。研究表明，降香黃檀表現(xiàn)較高的遺傳多樣性，且其適應(yīng)環(huán)境能力強，因此導致其瀕危的主要原因可能是其極高的藥用價值和工藝價值越來越得到人們重視，導致用量急劇增大，人為亂采濫挖所至[7]。原有文獻記載的有野生分布點區(qū)域，現(xiàn)已很難再找到該植物，比如2004年在三亞的南山附近零星

20、有分布降香黃檀小樹,到2006年時，該處已無降香黃檀?，F(xiàn)在降香黃檀只有在少數(shù)的保護區(qū)有少量分布，及部分植物園引種、收集保存和農(nóng)民種植所保留下來的，數(shù)量十分有限[8]。為保護降香黃檀種質(zhì)資源和遺傳多樣性,不只需要宣傳保護意識，還要大量地收集現(xiàn)有的降香黃檀種群的種質(zhì)資源，并加強管理措施，保持其種群中豐富的遺傳多樣性。采取就地保護、繁殖，遺傳性高且面積較小的群體[9]。相關(guān)的職能部門應(yīng)加大對偷采濫伐的監(jiān)管力度，盡量保護每株野生降香黃檀種質(zhì)資源

21、；全力開展對降香黃檀種質(zhì)保存及擴大繁殖的研究,擴大居群規(guī)模；同時通過高新技術(shù)的應(yīng)用，建立核心種質(zhì)庫的方式提高種質(zhì)資源管理的質(zhì)量和效率[10]。</p><p>　　1.1分子條形碼序列測定及其在木材應(yīng)用方面的研究進展</p><p>　　分子條形碼作為生命體所固有的遺傳物質(zhì)，通過DNA水平鑒定技術(shù)已成熟地應(yīng)用于動植物的鑒定[11-12]。作為客觀存在于細胞內(nèi)的物質(zhì)，不受人為因素干擾，能更客

22、觀且準確的反映出物種的最基本信息[13]。</p><p>　　分子條形碼技術(shù)的主要應(yīng)用于篩選出適合的DNA片段，它的黃金時代開始于 2003年。現(xiàn)在已成立的生命條形碼聯(lián)盟CBOL，一個國際自發(fā)組織的聯(lián)盟，在于支持 DNA 條形碼的發(fā)展，旨在促進全球的標準化以及相應(yīng)的 DNA 條形碼研究。分子條形碼技術(shù)研究的領(lǐng)域集中于針對具體的科屬，針對性地篩選合適的 DNA 條形碼。它利用一段標準的DNA片段區(qū)域作為物種標識，

23、進而快速準確地進行物種鑒定[14]。理想的 DNA 條形碼應(yīng)當滿足：有變異性、豐富的系統(tǒng)進化學信息、標準化、片段短、穩(wěn)定易獲取5個標準[15]。在查看參考文獻后從眾多研究成果中，選擇matK，trnH-psbA，ITS2三條國際生命條形碼聯(lián)盟所推薦的候選片段應(yīng)用于本次研究[19]。</p><p>　　matK片段長度約為1500bp，位于葉綠體基因內(nèi)含子內(nèi)，是葉綠體DNA編碼區(qū)進化速度最快的片段之一，編碼一種參

24、與轉(zhuǎn)錄RNA內(nèi)含子剪切的成熟酶 [20]。其在種內(nèi)種間變異，種內(nèi)種間差異較大可以作為所研究的天南星科、柑橘以及近緣植物、姜科砂仁屬植物植物DNA條形碼分類條形碼[21]。</p><p>　　trnH-psbA片段長度為318-322bp，是葉綠體間隔區(qū)進化速度最快的片段之一。該片段在很多研究中表現(xiàn)出很好的物種鑒定效果比如洋金花及其混偽；也可以鑒定山麥冬及其近緣種；在桉屬可用于潛在的條形碼鑒定研究[22]。<

25、;/p><p>　　ITS2片段長度為500-750bp,是核糖DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，為主要應(yīng)用于系統(tǒng)發(fā)生學標記的片段之一。由于該片段進化速度快，被很多的國內(nèi)外學者所重視，協(xié)和醫(yī)院陳士林科研組在研究了大量的植物樣本后提議把ITS2片段作為藥用植物DNA條形碼[23]?？茖W家發(fā)現(xiàn)豆蔻屬藥用植物、葫蘆科和景天屬藥用植物等等都發(fā)現(xiàn)ITS2序列可以作為所研究對象的DNA條形碼[24]。如今ITS2序列已成立了獨立的數(shù)據(jù)庫，數(shù)

26、據(jù)正不斷地在擴充。根據(jù)其二級結(jié)構(gòu)保守性，科學家可以通過軟件預(yù)測出ITS2的二級結(jié)構(gòu)，比較其結(jié)構(gòu)的差異同樣可以完成鑒定工作[25]。</p><p>　　1.2研究的目的與意義</p><p>　　降香黃檀野生資源已被大量破壞，瀕臨滅絕，但因其藥用和商業(yè)價值很高[26]，所以部分不良商販受利益驅(qū)使，用黃檀屬其他樹種冒充降香黃檀進行銷售，因它們密度、材色以及構(gòu)造與降香黃檀極非常相似[27]，專

27、業(yè)技術(shù)人員用傳統(tǒng)的識別方法很難鑒定，普通消費者更是無法區(qū)分和識別，這給消費者造成了巨大的經(jīng)濟損失，也給林業(yè)檢查和海關(guān)人員的識別工作增加了難度[28]。</p><p>　　在本次研究中，為了驗證國際生命條形碼聯(lián)盟推薦的MatK，trnH-psbA，ITS2三個候選條形碼對降香黃檀分子條形碼測定的有效性，用特異性引物對降香黃檀DNA進行PCR 擴增，擴增成功的DNA片段用于進一步測序分析，測序成功的條形碼片段可用于

28、降香黃檀的研究鑒定。以 PCR 擴增成功率和測序成功率初步評價候選 DNA 條形碼片段，為今后利用 DNA 條形碼鑒定木材和構(gòu)建木材分子條形碼數(shù)據(jù)庫提供理論依據(jù)。</p><p><b>　　2 材料與方法</b></p><p><b>　　2.1材料</b></p><p>　　基地種植的降香黃檀，采摘樹葉提取的DNA

29、作為實驗?zāi)０濉?lt;/p><p><b>　　2.2試劑藥品</b></p><p>　　瓊脂糖，TAE，Goldview,TaKaRa Ex Taq，6×10 Loading Buffer，dNTP Mixture，滅菌ddH2O，AL2000 MarKer。</p><p>　　2.3主要儀器設(shè)備 </p><p

30、>　　電子天平；量筒；燒杯；PCR儀；凝膠成像系統(tǒng)；高速冷凍離心機；低溫冰箱；移液槍（eppendprf：2.5µL；10µL；20µL；50µL；100µL）；移液管；微波爐；紫外分光光度計（NanoDrop ND-1000）；渦旋儀（IKA）；恒溫搖床；電泳儀、電泳槽；恒溫水浴鍋；恒溫培養(yǎng)箱；超凈工作臺；手掌型離心機。</p><p><b>

31、　　2.4 實驗步驟</b></p><p>　　2.4.1條形碼片段的 PCR 擴增</p><p><b>　?。?）擴增引物</b></p><p>　　特異性的 PCR 擴增也同樣要求引物的特異性，產(chǎn)物的特異性程度依賴于擴增引物和模板的互補程度。在本次研究中采用的引物長度為20至23，GC的含量為40%-60%，且沒有連續(xù)

32、排列的5個堿基[29]。引物名稱和序列見表1。</p><p>　　表1 候選條形碼片段的擴增引物</p><p>　　Table1. Primers for each candidate barcoding sequences amplification</p><p>　?。?） PCR反應(yīng)體系</p><p>　　采用25μL反應(yīng)體系，

33、各反應(yīng)成分：0.12μL TaKaRa Ex Taq，2.5μL 6×10 Lodaing Buffer，2μL dNTP Mixture，1μL上游引物，1μL下游引物，1μL DNA模板，加入17μL滅菌ddH2O至總體系25μL。</p><p>　?。?）PCR反應(yīng)條件</p><p>　　表2 候選條形碼片段的PCR反應(yīng)條件</p><p>　　

34、Table2.PCR conditions for candidate barcoding sequences</p><p>　　配置25μL反應(yīng)體系，用0.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測樣本DNA，左邊第一孔用移液槍注入5μL AL2000做對照。取1μL 6×10 Lod aing Buffer，5μL樣本DNA混合點樣于膠孔中。設(shè)置電泳儀U=120V，I=220mA，25分鐘后取出凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)

35、中紫外燈源下觀察PCR產(chǎn)物條帶。</p><p>　　2.4.2 條形碼片段的純化與檢測</p><p>　?。?）條形碼片段的純化</p><p>　　采用天根柱式核酸純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物（根據(jù)電泳檢測結(jié)果靈活確定待純化條形碼片段的PCR量）。 </p><p>　?、僭谧贤鉄粼聪?，用鋒利的手術(shù)刀片將單一的目的條形碼PCR產(chǎn)物條帶切下

36、，置于滅菌離心管中，并稱重。</p><p>　?、谌?00μL平衡液BL活化CA2吸附柱。</p><p>　?、郯此邢碌漠a(chǎn)物凝膠質(zhì)量，加入3倍體積溶膠液PN。</p><p>　?、?0℃水浴10min，期間上下顛倒數(shù)次，確保膠塊充分溶解。若依舊有未溶膠塊，補加適量溶膠液或延長水浴時間，直至膠塊完全溶解。</p><p>　　⑤待冷卻至

37、室溫的膠塊溶解液加入一個吸附柱 CA2 中，室溫放置 2min，13000*g離心力離心45s，丟棄流出液。</p><p>　?、藜尤?00μL漂洗液 PW 到吸附柱CA2中，13,000*g離心力離心1min。丟棄流出液，將吸附柱CA2放入收集管中。重復本操作一次。</p><p>　　⑦將吸附柱CA2放置收集管中，14000*g離心2min，除盡漂洗液。</p><

38、;p>　?、嗍覝胤胖梦街鵆A25min，徹底地晾干，避免殘留的漂洗液對下一步的實驗造成影響。</p><p>　?、釋⑽街鵆A2置于一個干凈離心管中，加入35μLddH2O(pH8.0)到吸附膜中間位置，室溫放置2min。13000*g離心2 min收集DNA流出液。</p><p>　　⑩將離心所得溶液重新加回吸附柱中，室溫放置 2min，13000*g 再次離心 2min，得

39、到純化后的條形碼PCR產(chǎn)物。</p><p>　?。?）電泳檢測純化后的條形碼PCR產(chǎn)物</p><p>　　用0.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測純化后的條形碼PCR產(chǎn)物。取5μL AL2000做對照,取5μL純化產(chǎn)物與1μL 6×10 Lodaing Buffer混合后，點樣于凝膠孔中，設(shè)置電泳儀U=120V，I=220mA，25分鐘后取出凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中紫外燈源下觀察PCR

40、產(chǎn)物條帶。</p><p><b>　　2.4.3克隆</b></p><p>　?。?）純化產(chǎn)物低溫連接</p><p>　　于超凈工作臺上吸取4µL純化后的條形碼PCR產(chǎn)物、1µL T Vector和連接液SolutionⅠ至同一PCR管中，輕彈管壁，使各組混合均勻，用手掌型離心機快速離心，集中溶液，然后置PCR管于P

41、CR儀上，16℃連接20min。反應(yīng)結(jié)束后將離心管置于冰上。</p><p><b>　?。?）大腸桿菌轉(zhuǎn)化</b></p><p>　?、僭诔瑑艄ぷ髋_上，取50µL感受態(tài)細胞并同時加入5µL連接產(chǎn)物(在感受態(tài)細胞剛剛解凍時加入鏈接產(chǎn)物)，輕彈混勻后于冰中30min；</p><p>　　②結(jié)束后，42℃水浴，熱激30S，迅

42、速再次冰浴2min；</p><p>　　③向混合液離心管中加入250µL滅菌LB培養(yǎng)基（不含氨芐青霉素），混合均勻后，于震蕩培養(yǎng)箱37℃200轉(zhuǎn)/min 震蕩培養(yǎng) 1h，可使得大腸桿菌復蘇；</p><p>　?、苋?80µL 2mg/mlIPTG和40mg/mlX-gal混合，并均勻地涂布在準備好的平板上，在37℃培養(yǎng)箱中放置30min；</p>&l

43、t;p>　　⑤待IPTG和X-gal被吸收后，取200µL菌液均勻地涂在平板上，在37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)（為得到更多的克隆，4000轉(zhuǎn)/min離心1min,棄掉部分上清，保留100-150µL，輕彈懸浮菌液，取全部菌液涂板）。</p><p><b>　?。?）藍白菌斑篩選</b></p><p>　　超凈工作臺上挑選白色單菌落，置于 LB

44、培養(yǎng)基中(含氨芐青霉素)，37℃恒溫震蕩培養(yǎng) 5-6h；鑒定陽性克隆需要以培養(yǎng)的菌液為模板，菌液 PCR 擴增目的條形碼片段。PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)以鑒定陽性克隆，PCR反應(yīng)體系及條件與以葉片DNA PCR擴增目的片段體系條件一致。</p><p><b>　　2.4.4 測序</b></p><p>　　將鑒定轉(zhuǎn)化后的菌液中的11, 22, 25, 30, 34,

45、40, 43共七個樣品寄送深圳華大基因科技有限公司實驗室測序，采用ABI 3730XL測序儀，采用正反雙向測序確保測序結(jié)果的可信度，采用DNAStar Lasergene 6軟件處理返回的序列，拼接和去引物。得到各樣本的片段序列信息。</p><p><b>　　3結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1條形碼片段 PCR 擴增結(jié)果</p>&l

46、t;p>　　DNA條形碼鑒定研究工作的核心在于篩選和鑒定，探索出合適的擴增引物，摸索建立起高效的擴增條件體系，然后評估對候選條形碼序列的PCR擴增成功率，以及測序所得高質(zhì)量的序列的測序成功率。這是對條形碼片段的初步評估。擴增，測序成功率的高低直接影響了后續(xù)條形碼序列分析。 </p><p>　　通過實驗得到三種引物PCR擴增結(jié)果如下圖，matK片段的擴增成功率低，在凝膠成像圖中找不到條帶。trnH-psbA

47、片段和ITS2片段，均有結(jié)果。而經(jīng)過純化后的產(chǎn)物凝膠顯示ITS2的條帶更為清晰。</p><p>　　圖1. 三種引物的PCR擴增產(chǎn)物電泳分析</p><p>　　Figure1. Electrophoretic analysis of three kinds of primers for PCR products</p><p>　　M: DNA marker (

48、 AL2000)</p><p>　　1-2: ITS2; 3-4: trnH-psbA,; 5-6: MatK</p><p>　　圖2. PCR擴增產(chǎn)物純化電泳分析</p><p>　　Figure2.Electrophoretic analysis of purified PCR products</p><p>　　M: DNA ma

49、rker ( AL2000)</p><p>　　1-3 :ITS2; 4-6 :ITS2; 7-9: trnH-psbA</p><p>　　3.2條形碼片段測序結(jié)果</p><p>　　將回收得到的trnH-psbA 片段、ITS2片段進行克隆，菌液PCR驗證（圖3），挑取檢測效果較好的條帶測序。</p><p>　　測序結(jié)果中:樣品DN

50、A的 trnH-psbA 片段均未得到對應(yīng)序列，只得到ITS2序列長度為654bp如下：</p><p>　　ACCTGAGGTCGCGTCGTGGGCGATCGACATCGCTCGCGGGTCGCTGGGTACGGAGCTGGTGGAGGCCGCCCTCATGACTGGCCTCGAGAACACGCTCAACCACCGTCTGTCATGGCGCTGCATCCACCACGAACCCGATTTTCAGCCAGCCGC

51、GAGGCGGTGCTCACGGGAGGCCAGCATTCGCCCCGCTCCGTGGCCGGAGGCACAGGGGTTGGGGCGGCGATTGGTGACACCCAGGCAGGCGTGCCCTTGGCCTAGTGGCTTCGGGCGCAACTTGCGTTCAAAGACTCGATGGTTCACGGGATTCTGCAATTCACACCAAGTATCGCATTTCGCTACGTTCTTCATCGATGCAAGAGCCGAGATATCCGTT

52、GCCGAGAGTCGTTTTGGACTCGAGTGTTGCGACGTCGCCCGTGCGAGCACCGTTTCCGGGCCGACGGGACGCGCTCTGCGATTGTTGATTCCTTGGCGCTTTCCGCGCCGGGGTTTGTTGGTTGTTT</p><p>　　圖3克隆菌液PCR產(chǎn)物電泳檢測</p><p>　　Figure3. Electrophoretic analysi

53、s of PCR products of cloning escherichia coli </p><p>　　M: DNA marker ( AL2000)</p><p>　　ITS2: 1-38 ; trnH-psbA: 39-48 </p><p><b>　　3.3序列分析</b></p><p>　　根據(jù)

54、 NCBI中已登錄的黃檀屬分子的ITS2序列，用DNAMAN做比對。樣品ITS2分子序列黃檀屬其他植物均不同，其中與越南黃檀差異最小有8個位點堿基不同，其次是多裂黃檀有15個堿基不同。</p><p>　　表1.降香黃檀、越南黃檀和多裂黃檀的特異性鑒別位點</p><p>　　Table 1 Identification sites of Dalbergia odorifera T. Ch

55、en, Dalbergia tonkinensis and Dalbergia rimosa Roxb in different origin sites</p><p>　　通過NCBI中已登錄的黃檀屬其他13個樹種和國槐屬植物國槐的ITS2序列，所得序列進行多重比對后采用鄰接(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(見圖4)。結(jié)果顯示，外類群槐屬植物的國槐單獨聚為一枝，與傳統(tǒng)分類結(jié)果相一致。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果說明降香黃檀與越南黃

56、檀有著較近的親緣關(guān)系其次才是多裂黃檀，但它們又不屬同一植物類群，且三者有著穩(wěn)定的遺傳差異性。</p><p>　　圖4 降香黃檀ITS2 序列與其他物種該序列的進化樹分析</p><p>　　Figure4.Phylogeny tree obtained by method based on the ITS sequnence</p><p><b>　

57、　4結(jié)論與討論</b></p><p><b>　　4.1結(jié)論</b></p><p>　　實驗結(jié)果表明降香黃檀DNA片段，用三種特異性引物擴增MatK，trnH-psbA，ITS2片段，其中trnH-psbA，ITS2均有擴增產(chǎn)物但只有ITS2通過 PCR 擴增成功，且擴增成功的 DNA 片段可用于測序分析，對降香黃檀分子條形碼測定的有效性最高。<

58、/p><p>　　通過NCBI查詢降香黃檀ITS2序列和其他黃檀屬植物不同，其中與越南黃檀差異最小其次是多裂黃檀，多重比對后構(gòu)建降香黃檀、越南黃檀和多裂黃檀的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示了三者有相當近的親緣關(guān)系又不屬于同一物種。建議把ITS2作為鑒定降香黃檀的候選片段。</p><p><b>　　4.2討論</b></p><p>　　隨著社會的不斷進步和經(jīng)濟

59、的高速發(fā)展，人們對木質(zhì)材料，特別是高檔木材制品的需求日益增加，出現(xiàn)了大量的非法采伐和過度采伐的現(xiàn)象。同時由于高檔珍稀木材與普通木材在價格上有著大較的差異，在經(jīng)濟利益的驅(qū)使下，高檔木制品市場上出現(xiàn)了大量的假冒偽劣產(chǎn)品，給消費者造成了非常大的經(jīng)濟損失。因此，為維護消費者合法利益，規(guī)范木材貿(mào)易市場，以及保護生態(tài)環(huán)境，對木材進行快速、準確、科學的識別鑒定就顯得十分重要和迫切。</p><p>　　本研究以基地種植的降香黃

60、檀（Dalbergia odorifera T.Chen）為研究對象，通過葉片DNA提取、純化和ITS序列測序，從而揭示降香黃檀和越南黃檀、多裂黃檀DNA序列之間的差異，為降香黃檀木材種屬鑒定提供可靠的分子標記依據(jù)。</p><p>　　本研究中有一些后續(xù)仍需要改進的地方，比如：運用了較為易于提取DNA的葉片，可以為苗木鑒定提供可行的檢測手段，但在實際應(yīng)用中市場上辨別木材是很難找到對應(yīng)的葉片用于檢測，而木材DNA

61、的提取與擴增相對于葉片比較困難。</p><p><b>　　致謝</b></p><p>　　歲月如梭，如歌。轉(zhuǎn)眼間，大學四年美好的學習時光已接近尾聲。感謝一直在身邊陪伴著我，呵護我成長的父母；衷心的感激這些年來對我悉心教導，誨人不倦的老師們；感謝在學習中給予我支持與幫助的同學；感謝在四年宿舍生活中，包容我，鼓勵我的舍友們。感謝這一路走來都有你們，能讓我能在遇到困難

62、的時候，有勇氣克服困難，爬起來繼續(xù)往前走。</p><p>　　畢業(yè)論文得以順利完成，我要衷心的感謝W老師，感謝老師在在繁忙的授課與科研中抽出時間給予耐心的教導和幫助。此外我還要感謝實驗室的師兄師姐，特別是L師姐對我耐心的幫助，悉心的指導。在此我還要感謝和我一起做《降香黃檀分子條碼確定》的M同學花了一個暑假的時間提出了降香黃檀的DNA。謝謝你們。我知道明天有風雨也有彩虹，我有勇氣、自信和能力經(jīng)歷風雨迎接彩虹，不辜

63、朋友，老師和家人的期望！</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 姜愛莉,孫利芹. 降香抗氧化成分的提取及活性研究[J]. 精細化工, 2004, 21(7) : 525 - 528.</p><p>　　[2] 張磊. 劉干中.降香的中樞抑制作用[J]. 上海中醫(yī)藥雜志, 1987, 12 : 39 - 40

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