泡桐屬DNA條形碼的篩選與鑒定研究.pdf

1、泡桐屬（Paulownia）是玄參科(Scrophulariaceae)中的一個(gè)屬，樹種為喬木。泡桐是原產(chǎn)于中國(guó)的重要速生用材樹種和綠化樹種之一，發(fā)展泡桐生產(chǎn)在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中有重要價(jià)值。目前泡桐存在優(yōu)良基因資源容易流失，有些種群數(shù)量較少的野生資源的極具減少，商品用材品種混亂，用材品質(zhì)不一等嚴(yán)重問題，需要得到準(zhǔn)確的鑒定，DNA條形碼技術(shù)是當(dāng)下較好的解決途徑之一。
　　DNA條形碼（DNA barcoding）技術(shù)是一種基于DNA分子進(jìn)化

2、原理，利用標(biāo)準(zhǔn)DNA片段和現(xiàn)代分子系統(tǒng)學(xué)的原理和方法對(duì)“傳統(tǒng)物種”進(jìn)行快速、準(zhǔn)確和自動(dòng)化的身份鑒定的最新生物學(xué)技術(shù)。DNA條形碼類似于超市里不同的商品對(duì)應(yīng)的可掃描條形碼。本研究以泡桐屬為研究對(duì)象，利用DNA條形碼技術(shù)，解決泡桐屬密切相關(guān)種的鑒定問題，對(duì)于泡桐屬植物近緣種鑒定、優(yōu)良用材親本選擇具有較高參考價(jià)值。同時(shí)篩選和建立泡桐屬DNA條形碼，以期為構(gòu)建泡桐屬植物的可視數(shù)字化的數(shù)據(jù)庫(kù)奠定基礎(chǔ)。
　　本研究選取葉綠體、核基因、線粒體基

3、因上的rps16、TrnK、rps2、rbcL、ITS2、ETS、nad1 intron2 DNA片段總計(jì)8個(gè)，提取泡桐屬12種2變種共51份材料的DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及其產(chǎn)物直接測(cè)序，通過擴(kuò)增效率和測(cè)序成功效率，用以研究DNA條形碼片段在泡桐屬中的通用性，同時(shí)分析其序列特征;本研究重點(diǎn)篩選了5個(gè)DNA條形碼候選序列rps16、TrnK、ITS2、ETS，TrnL-F，用于泡桐屬DNA條形碼的分析和鑒定研究。研究結(jié)果如下:
　　

4、(1)8個(gè)DNA條形碼片段在泡桐屬中的通用性分析:PCR擴(kuò)增效率和測(cè)序成功率是評(píng)價(jià)DNA條形碼序列的2個(gè)重要指標(biāo)。rps16、TrnK、trnL-F、rps2、rbcL、nad1intron2、ITS2、ETS8個(gè)DNA片段的PCR擴(kuò)增效率為100％，測(cè)序成功率為69.8％～100％。發(fā)現(xiàn)各DNA片段在泡桐屬中均顯示出較好的通用性，故可將其作為泡桐屬DNA條形碼候選序列開展進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。
　　(2)DNA條形碼序列特征分析:8個(gè)DN

5、A片段的全序列比對(duì)排列后的長(zhǎng)度分別為239 bp～1828 bp;總變異位點(diǎn)數(shù)分別為2～84個(gè)，其中堿基替換位點(diǎn)數(shù)分別為2～83個(gè)。GC含量分別為33.14％～72.19％。其中TrnK序列分析表明，在蘭考泡桐，其中在1660bp的位點(diǎn)插入G，被鑒定。其中ITS2序列分析表明，山明泡桐在188 bp位點(diǎn)插入A，作為山明泡桐的特異位點(diǎn)被鑒定。其中ETS序列分析表明，楸葉泡桐在191 bp位點(diǎn)上堿基缺失（C→-），238bp位點(diǎn)上(G→A)

6、，304 bp位點(diǎn)上(A→C)。楸葉泡桐因?yàn)檫@些特異序列特征，可以被鑒定。
　　綜上所述，rps16、TrnK、ITS2、ETS序列的變異位點(diǎn)較多，說明它們?cè)谂萃僦械倪M(jìn)化速率較快，可用于泡桐屬的系統(tǒng)學(xué)和分類學(xué)的研究。
　　(3)泡桐屬DNA條形碼的篩選和鑒定:通過種內(nèi)種間的變異性，Barcodinggap的分析，種的鑒別效率來衡量rps16、TrnK、ITS2、ETS TrnL-F5個(gè)DNA片段的有效性。結(jié)果如下:

7、　　rps16序列的種間變異變異度為0.027％，平均變異(Theta prime)為0.031％，種間最小變異為0;種內(nèi)變異度為0.021％，平均變異（Theta）為0.025％，種內(nèi)最大變異（Coalescent dept）為0.052％。 Barcoding gap圖示rps16存在barcoding gap。通過BLAST1方法鑒定效率達(dá)13.33％。
　　TrnK序列的種間變異度為0.091％，平均變異為0.090％，種

8、間最小變異為0.012％;種內(nèi)變異度為0.048％，平均變異為0.052％，種內(nèi)最大變異為0.063％。通過BLAST1方法顯示TrnK序列的鑒定效率達(dá)21.42％。
　　ITS2序列的種間平均變異為2.096％，種間最小變異為0.186％;平均變異為0.822％，種內(nèi)最大變異為1.354％?？傮w來說，種間的變異較大，種內(nèi)變異較小。barcoding gap圖顯示ITS2序列存在barcoding gap。BLAST1方法對(duì)ITS

9、2序列鑒定效率達(dá)50％。ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)分析圖顯示興山泡桐具有4個(gè)莖環(huán)，優(yōu)先鑒別出來;臺(tái)灣泡桐，華東泡桐均具有5個(gè)莖環(huán)，結(jié)構(gòu)很相似，但還是有細(xì)微的區(qū)別，如相比華東泡桐的結(jié)構(gòu)，臺(tái)灣泡桐的結(jié)構(gòu)在最長(zhǎng)的堿基對(duì)上，多了一個(gè)內(nèi)環(huán)。這充分證明了ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析，對(duì)于泡桐的鑒別具有重要意義。綜合發(fā)現(xiàn)ITS2序列可以做為泡桐屬物種的候選DNA條形碼片段。
　　ETS種間變異變異度為3.555％，平均變異為3.906％，種間最小變異為0.54

10、4％;種內(nèi)變異度為1.697％，平均變異為1.542％，種內(nèi)最大變異為2.895％。總體來說，種間存在較大的變異。BLAST1和Nearest Distance方法顯示ETS的鑒定效率達(dá)28.57％，有一定的鑒定能力。
　　TrnL-F序列的種間變異變異度為0.142％，平均變異為0.132％，種間最小變異為0.008％;種內(nèi)變異度為0.096％，平均變異為0.065％，種內(nèi)最大變異為0.127％?？傮w來說，種內(nèi)種間的變異都不大。