地黃DNA條形碼序列的篩選與鑒定研究.pdf

1、DNA條形碼是目前廣泛使用并有效的分類工具，能夠快速準(zhǔn)確的識(shí)別鑒定物種，對(duì)生物多樣性分析產(chǎn)生重大的影響。已研究出COI基因是識(shí)別鑒定魚類、昆蟲(chóng)和鳥(niǎo)類等動(dòng)物的理想DNA條形碼，而植物中適合作為DNA條形碼的片段仍處在探索階段，主要在質(zhì)基因和核基因中進(jìn)行選擇，但是還未達(dá)成共識(shí)。本研究以地黃屬為研究對(duì)象，比較和評(píng)價(jià)ITS、ITS2、matK、rbcL、psbA-trnH序列及其組合在地黃屬物種的辨別能力及鑒定效果，以期為植物DNA條形碼的篩選

2、、物種鑒定提供理論依據(jù)。主要結(jié)果如下:
　　1、ITS、ITS2和psbA-trnH片段擴(kuò)增的引物通用性較好，由于matK和rbcL序列需要擴(kuò)增全長(zhǎng)、引物通用性差、要提高擴(kuò)增效率等，對(duì)這兩個(gè)基因的擴(kuò)增引物進(jìn)行篩選，最終使用引物1f-724r、636f-1368r擴(kuò)增地黃rbcL序列，matK1F-tmk2R擴(kuò)增地黃matK序列。經(jīng)過(guò)引物篩選、PCR擴(kuò)增優(yōu)化，本研究中地黃的5個(gè)序列引物通用性好、易擴(kuò)增、易測(cè)序，有效序列獲得率100％

3、，其中地黃ITS序列因存在poly結(jié)構(gòu)，需要結(jié)合ITS2序列測(cè)序結(jié)果進(jìn)行校對(duì)。
　　2、地黃ITS2、ITS具有較高的變異率和較多的信息位點(diǎn)，且多為嘌呤與嘌呤之間、嘧啶與嘧啶之間的堿基置換，而地黃rbcL和matK則保守性強(qiáng)。地黃ITS2顯示出最高的種間多樣性和較低的種內(nèi)變異，無(wú)論是序列自身種內(nèi)種間相比，還是序列之間遺傳距離的比較，地黃ITS2序列較其它序列效果最優(yōu)，而rbcL和matK種內(nèi)種間差異小不足以用來(lái)鑒定地黃屬物種。地黃

4、psbA-trnH序列有0.4％-0.6％的gap，地黃ITS、ITS2和matK雖然沒(méi)有明顯的gap，但是種內(nèi)種間距離各集中在坐標(biāo)軸的兩側(cè)，同時(shí)得到統(tǒng)計(jì)學(xué)支持ITS2＞＞ITS＞＞psbA-trnH＞＞ matK＞＞ rbcL，地黃ITS2具有極顯著的種間差異，驗(yàn)證了ITS2序列在種間水平或種下水平具有明顯的序列變異性。另外，地黃屬6個(gè)種ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)差異顯著，親緣關(guān)系近的物種，二級(jí)結(jié)構(gòu)相似，但是地黃屬6個(gè)種motif相對(duì)保守。

5、r>　　3、本研究選擇地黃ITS2和psbA-trnH序列進(jìn)行拼接，將高變異率、種間多樣性顯著的ITS2序列與種內(nèi)種間差異同樣顯著的psbA-trnH序列相結(jié)合。片段組合長(zhǎng)度708-721bp符合理想條形碼要求，兩個(gè)序列都易擴(kuò)增、易測(cè)序、引物通用性好，有一定數(shù)量的變異位點(diǎn)和信息位點(diǎn)。種內(nèi)種間距離差異較大，有明顯的barcoding gap，而且gap距離較大0.6％-1.4％，優(yōu)于單個(gè)序列，片段組合有一定的實(shí)際意義，有利于分類鑒定。

6、r>　　4、以地黃ITS、ITS2構(gòu)建NJ樹(shù)，能夠成功鑒定地黃、天目地黃、湖北地黃，具有明顯的單系性，高地黃和裂葉地黃聚為一枝，未能將茄葉地黃和地黃區(qū)分開(kāi)，表明地黃和茄葉地黃親緣關(guān)系較近，此外天目地黃和湖北地黃親緣關(guān)系也較近。以地黃ITS2+psbA-trnH、psbA-trnH構(gòu)建NJ樹(shù)，能將栽培種與野生種區(qū)分開(kāi)。地黃matK和rbcL序列能夠?qū)⒌攸S屬品種聚類在一起，鑒定地黃及混偽品，但是不能對(duì)地黃屬物種進(jìn)行分類，無(wú)法區(qū)分屬內(nèi)種間差異

7、。候選條形碼序列的鑒定效果表明，地黃屬最適宜的條形碼序列為ITS2，psbA-trnH序列為補(bǔ)充序列，片段組合選擇ITS2+psbA-trnH，marK和rbcL變異率低，不適合地黃屬內(nèi)種間分類鑒定。
　　5、采自輝縣九蓮山的樣品，形態(tài)學(xué)角度推測(cè)為地黃，經(jīng)BLAST搜索分析，該樣品參考ITS序列初步鑒定為小花琉璃草（Cynoglossum lanceolatum），參考matK序列初步鑒定為紅花琉璃草（Cynoglossum of