沙田柚自交不親和分子機(jī)理研究.pdf

1、沙田柚是我國(guó)傳統(tǒng)優(yōu)良柚品種，種植面積較大，由于其具有自交不親和特性，在生產(chǎn)中需合理配置授粉樹或人工授粉，費(fèi)時(shí)費(fèi)力?，F(xiàn)實(shí)中由于柑橘屬中許多品種具有很強(qiáng)的單性結(jié)實(shí)能力，如果這些品種同時(shí)伴有自交不親和特性，生產(chǎn)中不僅無(wú)需配置授粉樹，而且獲得的是無(wú)籽果實(shí)，這也正是柑橘育種者一直努力追求的目標(biāo)之一。因此探究柚類植物自交不親和內(nèi)在機(jī)制具有重要的理論和實(shí)際意義。近些年關(guān)于植物自交不親和機(jī)理研究雖然在十字花科、薔薇科、玄參科以及罌粟科等物種上取得了顯著

2、進(jìn)展，然而關(guān)于沙田柚等柑橘屬植物自交不親和研究?jī)H僅還處于起步階段，其內(nèi)在可能的遺傳及分子調(diào)節(jié)機(jī)制至今不明，尤其是控制其自交不親和特性的關(guān)鍵基因，如雌蕊決定因子、花粉決定因子至今還未被克隆。本研究選取自交親和突變材料秭歸沙田柚為試驗(yàn)材料，以對(duì)應(yīng)的自交不親和材料廣西沙田柚材料為參照，開展如下工作:
　　1)形態(tài)學(xué)比較結(jié)果顯示，秭歸沙田柚與廣西沙田柚在葉型指數(shù)氣孔密度等指標(biāo)并無(wú)差別，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示兩材料同為二倍體植株，并且雌雄蕊

3、發(fā)育都正常。自交不親和材料的廣西沙田柚自交授粉后花粉管在花柱中上部被抑制，花粉管不能穿透花柱進(jìn)入子房，而自交親和材料秭歸沙田柚自交授粉后花粉管可以正常萌發(fā)生長(zhǎng)并且穿過花柱進(jìn)入子房發(fā)生授粉受精。進(jìn)一步觀察表明在秭歸沙田柚自交授粉后35天合子胚發(fā)育出現(xiàn)異常，最終導(dǎo)致種子敗育。
　　2)利用秭歸沙田柚七個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的花為材料，構(gòu)建柚cDNA全長(zhǎng)文庫(kù)，將文庫(kù)陽(yáng)性克隆測(cè)序，共計(jì)獲得3962條有效序列經(jīng)序列拼接，去除冗余，最終獲得2228條

4、高質(zhì)量的柚花器官Unigene，其中包含451條片段重疊序列以及1777條單一序列。將所獲得的柚花器官Unigene經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，1266條可以找到對(duì)應(yīng)的同源序列基因注釋，其中891條序列具有一個(gè)以上注釋信息。經(jīng)GO功能注釋，760個(gè)基因參與分子功能，1189個(gè)基因參與生物進(jìn)程，1154個(gè)基因參與細(xì)胞組成。在有注釋信息的柚Unigene中包含有花器官發(fā)育、器官分化以及細(xì)胞循環(huán)等基因。利用文庫(kù)測(cè)序獲得的contig序列本研究開發(fā)出

5、115個(gè)沙田柚SNP位點(diǎn)，選取Contig34中SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物在五個(gè)柑橘屬材料中片段擴(kuò)增，序列比對(duì)，結(jié)果證實(shí)預(yù)測(cè)SNP位點(diǎn)的可靠性。進(jìn)一步通過檢測(cè)花發(fā)育相關(guān)標(biāo)志性基因表達(dá)，證明該文庫(kù)囊括所需各類組織特異性表達(dá)基因，滿足后續(xù)工作需要。
　　3)利用構(gòu)建文庫(kù)獲得的2228條柚Unigene序列，我們開發(fā)出161對(duì)柚EST-SSR引物，其中130對(duì)引物在柑橘屬植物中具有通用性。經(jīng)枳殼和紅橘及其96個(gè)子代群體檢測(cè)，61對(duì)柚EST-SS

6、R引物適合柑橘遺傳連鎖圖譜構(gòu)建。在所開發(fā)出的通用引物中，通用率在柑橘屬不同種中并不相同，甜橙、橘、檸檬、金柑以及枳中通用率分別為76％、76％、75％，、74％和73％。利用我們開發(fā)的柚EST-SSR引物，在39份柑橘不同近緣種材料中擴(kuò)增，親緣關(guān)系聚類結(jié)果表明，柚EST-SSR可以清楚的將柑橘不同種材料區(qū)分開來(lái)，證明柚EST-SSR引物適合柑橘類植物遺傳多樣性分析，親緣關(guān)系及品種鑒定;此外利用其中120對(duì)柚EST-SSR引物擴(kuò)增篩選，最

7、終獲得一對(duì)可靠性極高的能夠證明秭歸沙田柚材料與廣西沙田柚在DNA分子水平存在穩(wěn)定差異的引物。
　　4)利用文庫(kù)獲得的2228條Unigene序列信息，我們篩選到與已知控制自交不親和基因S-RNase高度同源基因，命名為S-likeRNase基因，利用RACE技術(shù)獲得全長(zhǎng)序列，其ORF區(qū)由834bp組成，編碼一個(gè)由278個(gè)氨基酸組成的蛋白，分子量大小為31.3KDa，等電點(diǎn)為5.42。柚S-likeRNase與已知控制自交不親和的S

8、-RNase基因具有高度的同源性，并且都包含有五個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，即C1、C2、C3、C4、C5結(jié)構(gòu)域，此外還包含有兩個(gè)組氨酸活性位點(diǎn)，七個(gè)保守半胱氨酸殘基，聚類分析表明我們獲得的柚S-likeRNase與金魚草的AhSL28最為接近。Southern雜交證實(shí)該基因在柚類中以單拷貝形式存在;表達(dá)分析表明該基因在柚花器官不同組織中都有表達(dá)，不同于控制自交不親和的S-RNase基因具有特異性在花柱中表達(dá)特性，該結(jié)果證明柚類材料中并不具有與S-

9、RNase介導(dǎo)自交不親和相似機(jī)制，也說(shuō)明柚類植物中存在新的控制自交不親和遺傳機(jī)制。進(jìn)一步時(shí)空表達(dá)分析，結(jié)果表明柚S-lileRNase特異性地在成熟子房中上調(diào)表達(dá)，暗示該基因可能參與子房成熟衰老過程。
　　5)利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，詳細(xì)比較了自交親和材料秭歸沙田柚與自交不親和材料廣西沙田柚成熟花粉，花柱蛋白表達(dá)譜，通過篩選將花柱，花藥差異蛋白切膠回收，共計(jì)200個(gè)蛋白點(diǎn)經(jīng)MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜分析，最終共獲得188個(gè)有效蛋白

10、點(diǎn)，其中花柱差異蛋白點(diǎn)共計(jì)有116個(gè);花粉差異蛋白點(diǎn)共計(jì)有72。將我們鑒定到的差異蛋白經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后，結(jié)果表明其中并未發(fā)現(xiàn)與控制薔薇科等配子體自交不親和相關(guān)的S-RNase蛋白存在，該結(jié)果更進(jìn)一步證明我們前面的結(jié)論即控制柚自交不親和遺傳機(jī)制不同與S-RNase介導(dǎo)的自交不親和機(jī)制。特別值得注意的是，我們鑒定到的多個(gè)與十字花科自交不親和相關(guān)基因即S位點(diǎn)受體激酶即SRK基因，本研究中獲得的大量S位點(diǎn)受體激酶類蛋白信息為我們進(jìn)一步研究