綿羊MHC class I區(qū)段部分BAC克隆基因組成與結(jié)構(gòu)分析.pdf

1、目的：以中國(guó)美利奴羊BAC文庫(kù)中含有MHC片段的346G21及239C1克隆為材料通過(guò)酶切、末端標(biāo)記制備放射性DNA探針，與已構(gòu)建的中國(guó)美利奴羊cDNA文庫(kù)進(jìn)行噬菌體原位雜交以篩選含有MHC class I區(qū)段基因序列的目的克隆，通過(guò)對(duì)篩選出的目的克隆進(jìn)行測(cè)序及生物信息學(xué)分析，研究346G21及239C1克隆所在區(qū)段中基因的組成及結(jié)構(gòu)。
　　 方法：
　　 (1)中國(guó)美利奴羊BAC文庫(kù)中含有MHC片段的346G21及23

2、9C1陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，利用GENSCAN基因預(yù)測(cè)工具（New GENSCAN Web Server at MIT）預(yù)測(cè)該克隆可能包含的基因，以該克隆為材料進(jìn)行酶切，利用Taq DNA聚合酶進(jìn)行放射性末端標(biāo)記。利用標(biāo)記好的放射性DNA探針進(jìn)行噬菌體原位雜交，篩選中國(guó)美利奴羊cDNA文庫(kù)，通過(guò)放射自顯影技術(shù)獲得目的克隆。
　　 (2)對(duì)獲得的噬菌體單克隆，利用試劑盒提供的XLOLR菌和Helper Phage將獲得的噬菌體單克隆的

3、插入片段轉(zhuǎn)化至pBK-CMV載體，保存于XLOLR菌體中，提取轉(zhuǎn)化后的載體質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。通過(guò)對(duì)目的克隆進(jìn)行測(cè)序及生物信息學(xué)分析,研究346G21及239C1 BAC克隆中基因的組成進(jìn)而分析該區(qū)段的基因結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)果：本研究對(duì)MHC ClassⅠ區(qū)段的BAC探針雜交篩選美利奴細(xì)毛羊cDNA文庫(kù)的實(shí)驗(yàn)中32P末端標(biāo)記探針的制備方法進(jìn)行了改進(jìn)，采用Taq DNA聚合酶替代Klenow Fragment進(jìn)行末端標(biāo)記，并驗(yàn)證了該方

4、法適用于本實(shí)驗(yàn)。利用標(biāo)記后的探針對(duì)探針的陽(yáng)性對(duì)照DNA片段進(jìn)行雜交，探討了放射性雜交條件及雜交完成后游離探針的洗脫條件，初步判定了雜交篩選cDNA文庫(kù)的條件。通過(guò)噬菌體原位雜交篩選得到了27個(gè)陽(yáng)性克隆，并對(duì)其進(jìn)行了測(cè)序及生物信息學(xué)分析。
　　 結(jié)論：所制備的32P標(biāo)記DNA探針適用于噬菌體原位雜交篩選cDNA文庫(kù)，為cDNA文庫(kù)的高通量篩選提供了一個(gè)簡(jiǎn)易的放射性探針制備及雜交篩選平臺(tái)。篩選得到的cDNA單克隆經(jīng)過(guò)測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)