草魚MHC I區(qū)基因生物信息學(xué)及表達(dá)分析.pdf

1、草魚（Ctenopharyngodon idella）是我國的“四大家魚”之一，也是重要的經(jīng)濟(jì)淡水養(yǎng)殖魚類。但在養(yǎng)殖過程中由于各種病害的影響使其成活率極低，給養(yǎng)殖人員帶來的嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。其中，由嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）侵襲而引發(fā)的細(xì)菌性敗血癥是在草魚養(yǎng)殖過程中嚴(yán)重危害其機(jī)體健康的疾病之一。主要組織相容性復(fù)合體(MHC)存在于所有的脊椎動(dòng)物中，是機(jī)體免疫反應(yīng)中參與抗原呈遞的重要組成部分，其中包含許多不同的

2、基因。本文中通過本地Blast來獲取草魚MHCⅠ區(qū)的基因組信息，并將其與人類MHC以及其他魚類的MHCⅠ區(qū)在基因組層面上進(jìn)行比對(duì)分析，了解MHC在不同物種中的共同點(diǎn)有助于進(jìn)化分析，采用RT-PCR技術(shù)檢測MHCⅠ區(qū)基因在健康草魚各組織的表達(dá)情況，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測草魚在嗜水氣單胞菌感染后4、12、24、48及96h，MHCⅠ區(qū)免疫相關(guān)基因在脾臟和腎臟中的表達(dá)情況，以為草魚的抗病育種提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)數(shù)據(jù)，本文主要研究結(jié)果如下:

3、
　　1.草魚MHCⅠ區(qū)基因組成
　　經(jīng)分析得到草魚MHCⅠ區(qū)共有21個(gè)基因，全長為350Kb，其中包含3個(gè)MHCIa基因、5個(gè)PSMB基因、3個(gè)TAP2基因、2個(gè)TAPBP基因以及BRD2、FABGL、COL11A2、RXRB、KNSL2、ZBTB22、DAXX、 FLOT1這8個(gè)基因。
　　2.草魚MHCⅠ區(qū)與其他脊椎動(dòng)物的基因組比對(duì)分析
　　通過人類、大西洋鮭（Salmo salar）、草魚、斑馬魚（Dan

4、io rerio）、青鯔（Oryziaslatipes）以及日本河豚（Tetraodontidae）的MHCⅠ區(qū)基因組比對(duì)發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)比較保守的共線性區(qū)域，根據(jù)它們所在的位置分為在人類中經(jīng)典的MHCⅡ區(qū)和延伸的MHCⅡ區(qū)，其中經(jīng)典的MHCⅡ區(qū)包含PSMB8、PSMB9、PSMB10、TAP2、BRD2、FABGL、COL11A2以及RXRB在內(nèi)的8基因，延伸的MHCⅡ區(qū)包含KNSL2、ZBTB22、DAXX、 TAPBP以及FLOT1這5

5、個(gè)基因，其中KNSL2、ZBTB22、DAXX、 TAPBP這4個(gè)基因在魚類中有共線性關(guān)系。
　　3.MHCⅠ區(qū)抗原呈遞相關(guān)基因生物信息學(xué)分析
　　通過NCBI查找得到草魚TAPBP的396個(gè)氨基酸序列，通過SMART在線預(yù)測及Clustal X2比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)其存在TAPBP保守的Ig V和Ig C區(qū)域，在N-端的31位和106位都有保守的半胱氨酸，在Ig V和Ig C這兩個(gè)區(qū)域存在典型的半胱氨酸和色氨酸（C192、W211

6、、C270和C314、W327、C378），人類中115位的半胱氨酸在鳥類和魚類中被絲氨酸所代替。用DNAMAN軟件將草魚PSMB9的cDNA序列翻譯得到190個(gè)氨基酸，用SMART在線預(yù)測得到1-178的氨基酸為Proteasome的蛋白結(jié)構(gòu)域，通過Clustal X2軟件進(jìn)行氨基酸比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)魚類、哺乳動(dòng)物和兩棲類的Proteasome結(jié)構(gòu)域高度保守。在NCBI中查找得到草魚MHCⅠ的342個(gè)氨基酸，用SMART在線預(yù)測得其結(jié)構(gòu)域，

7、1-16位為信號(hào)肽，17-192位為MHCⅠ蛋白結(jié)構(gòu)域，208-281位為IGc1功能區(qū)，297-319位為蛋白質(zhì)跨膜區(qū)。通過MEGA7.0進(jìn)行TAPBP、PSMB9和MHCⅠ這三個(gè)基因物種間的進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，草魚均與鯉科魚類的關(guān)系最近，與其他魚類關(guān)系較遠(yuǎn)，與其他脊椎動(dòng)物關(guān)系最遠(yuǎn)。
　　4.草魚MHCⅠ區(qū)基因的組織表達(dá)特征
　　用半定量RT-PCR方法檢測了草魚MHCⅠ區(qū)BRD2、KNSL2、RXRB、TAPBP、FABGL、

8、MHC Ia、PSMB6、PSMB9以及TAP2等9個(gè)基因在健康魚各組織的表達(dá)情況。除了FABGL和PSMB6基因在腎臟表達(dá)量最高外，其它基因都在血液中的表達(dá)量最高。其中參與MHCⅠ類分子抗原呈遞途徑的TAPBP、MHC Ia、PSMB9以及TAP2基因的表達(dá)情況基本相同，而且都在免疫組織脾臟和腎臟中有較高表達(dá)。
　　5.草魚MHCⅠ區(qū)BRD2、MHC Ia、PSMB9以及TAP2在細(xì)菌感染后表達(dá)量變化
　　通過實(shí)時(shí)熒光定量

9、RT-PCR檢測看草魚腎臟和脾臟中MHCⅠ區(qū)免疫相關(guān)基因在嗜水氣單孢菌感染后的表達(dá)情況。BRD2表達(dá)量分別在感染后12h和24h在腎臟和脾臟中達(dá)到最高;MHC Ia表達(dá)量在脾臟和腎臟中都先上升后下降，并都在24h達(dá)最大值;PSMB9表達(dá)量在脾臟先上升后下降，在12h達(dá)最大值，在腎臟中則先下降后上升，在24h達(dá)最大值;TAP2在脾臟和腎臟中整體呈先下降后上升的趨勢，在24h都達(dá)最大值，并最后都回調(diào)至正常范圍。
　　本研究結(jié)果初步獲得