基于線粒體ｄｎａ中日白姑魚分類地位研究【畢業(yè)論文】

1、<p>　　本科畢業(yè)論文(設(shè)計)</p><p>　題 目：基于線粒體ＤＮＡ中日白姑魚分類地位研究</p><p>　學(xué) 院：</p><p>　學(xué)生姓名：</p><p>　專 業(yè)：農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境</p><p>　班 級：</p><p>　指導(dǎo)教師：<

2、;/p><p>　起止日期：</p><p><b>　　目錄</b></p><p>　　中文摘要…………………………………………………………………………… 1</p><p>　　英文摘要…………………………………………………………………………… 2</p><p>　　1.前言………………………

3、……………………………………………………… 3</p><p>　　1.1白姑魚形態(tài)特征與分布…………………………………………………… 3</p><p>　　1.2研究方法及意義…………………………………………………………… 3</p><p>　　2.材料與方法．…………………………………………………………………… 5</p><p&

4、gt;　　2.1實(shí)驗(yàn)材料…………………………………………………………………… 5</p><p>　　2.2基因組DNA的提取…………………………………………………………5</p><p>　　2.3 PCR擴(kuò)增…………………………………………………………………… 6</p><p>　　2.4 PCR產(chǎn)物的純化…………………………………………………………… 6&

5、lt;/p><p>　　2.5測序………………………………………………………………………… 6</p><p>　　2.6數(shù)據(jù)分析…………………………………………………………………… 7</p><p>　　3.結(jié)果……………………………………………………………………………… 7</p><p>　　3.1堿基組成…………………………………

6、………………………………… 7 </p><p>　　3.2單倍型及核苷酸多態(tài)度…………………………………………………… 8</p><p>　　3.3遺傳距離及NJ系統(tǒng)樹……………………………………………………… 9</p><p>　　4.討論 …………………………………………………………………………… 15</p><p>　　

7、致謝 …………………………………………………………………………… 16</p><p>　　參考文獻(xiàn)……………………………………………………………………………17</p><p>　　基于線粒體ＤＮＡ中日白姑魚分類地位研究</p><p>　　[摘要] 本文通過對白姑魚分布區(qū)4個群體共90個個體的線粒體DNA控制區(qū)序列和部分個體細(xì)胞色素b序列進(jìn)行測定和分析，來

8、探討中、日白姑魚之間的親緣關(guān)系和遺傳多樣性。在東海、青島近海、廣州近海及日本有明海90個個體中共檢測得到78個單倍型，得到479bp的線粒體控制區(qū)目的片段。控制區(qū)序列富含A和T堿基，A+T平均含量達(dá)到65.2%，而G堿基相對缺乏，平均僅為14.1%，這說明控制區(qū)在堿基的組成上具有明顯的偏向性。</p><p>　　在控制區(qū)序列和細(xì)胞色素b序列上，NJ系統(tǒng)樹均顯示存在中日兩個完全隔離的地理分支，中日群體間無共享單倍

9、型，成對的FST值清楚地表明白姑魚中日群體間有顯著的遺傳分化。中國群體的核苷酸多態(tài)度明顯高于日本群體?；诰€粒體控制區(qū)序列得到中、日白姑魚群體的平均遺傳距離為0.0239，而基于Cytb基因得到中、日白姑魚群體的平均遺傳距離為0.0127。中性檢驗(yàn)和核苷酸不配對分布表明白姑魚中日兩支都經(jīng)歷了群體擴(kuò)張，基于控制區(qū)序列和基于Cytb基因的分子方差分析結(jié)果和FST值顯示中國群體間的遺傳分化情況有所差異，可能是因?yàn)镃ytb基因的進(jìn)化比控制區(qū)基因

10、慢，Cytb基因的遺傳分化稍滯后于線粒體控制區(qū)基因。本研究為進(jìn)一步深入探討白姑魚中日組群的遺傳分化提供了有力依據(jù)，研究結(jié)果可作為更新世晚期冰期歷史事件的一個佐證，同時可以為對白姑魚資源采取適當(dāng)措施予以增殖、保護(hù)、合理利用提供了基礎(chǔ)資料，從而在維護(hù)漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展上具有重要意義。</p><p>　　[關(guān)鍵詞] 白姑魚 線粒體DNA 遺傳分化 線粒體控制區(qū) Cytb基因</p><p>

11、;　　Study in genetic variation between Chinese and Japanese populations Argyrosomus argentatus based on mitochondrial DNA</p><p>　　[Abstract] Ninety individuals of Pennahia argentata were sampled from 4 local

12、ities to evaluate the genetic variation between Chinese and Japanese Argyrosomus argentatus based on mitochondrial DNA cytochrome b gene and control region sequences. The 90 individuals from the east China sea, Qingdao,

13、Guangzhou, and Ariake Sound in Japan,were examined with a 479bp segment of mtDNA control region and 78 haplotypes. There was a bias of the content of A and T in the control region, coming up to 65.2%.The</p><p

14、>　　The neighbor joining tree showed there were two totally separated clades,one in the Chinese coastal waters and the other in the Japanese coastal waters, and the pairwise FST value clearly showed that the genetic va

15、riation was mainly occurred between the Chinese and Japanese groups, and These clades may have been isolated and diverged during Pleistocene low sea levels.Nucleotide diversity was much higher in the Chinese clade than t

16、hat in the Japanese clade. The average genetic distance of P.argen</p><p>　　[Keywords] Pennahia argentata mitochondrial DNA Genetic variation mtDNA control region cytochrome b gene</p

17、><p>　　基于線粒體ＤＮＡ中日白姑魚分類地位研究</p><p><b>　　1 前言</b></p><p>　　1.1白姑魚形態(tài)特征與分布</p><p>　　白姑魚(Pennahia argentata)，又稱白姑子、百米子、白梅、白花魚，隸屬于鱸形目(Perciformes)、石首魚科(Sciaenidae)、白

18、姑魚屬(Pennahia)，為西北太平洋所特有的暖溫性底層魚類[1]，分布于日本本州島東北部至中國廣東海域[2]，屬于重要經(jīng)濟(jì)魚類。白姑魚棲息于熱帶海洋沿岸泥沙質(zhì)底部，深度10-60米，生殖季節(jié)結(jié)群向近海洄游。大部分2齡性成熟（少數(shù)1齡），絕對生殖力為2.3萬-19.0萬粒。產(chǎn)卵期5—6月，產(chǎn)浮性卵，產(chǎn)卵地點(diǎn)在近岸[3]。</p><p>　　白姑魚肉厚而細(xì)嫩，體延長，側(cè)扁。吻圓鈍，吻褶完整，不分葉。口大，前位。

19、上顎長于下顎。頦孔6個，細(xì)小，中央頦孔和內(nèi)測頦孔呈四方形排列，外側(cè)頦孔存在，無頦須。鰓蓋上方有一大黑斑塊。體被櫛鱗，背鰭和臀鰭基部具1行鱗鞘。背鰭基部長且連續(xù)，起點(diǎn)在胸鰭基部上方，鰭棘部和鰭條部之間有一深凹，具11鰭棘、25~27鰭條。臀鰭2鰭棘、7鰭條，第二鰭棘長，與眼徑約等長。尾鰭楔形。背鰭鰭棘部都無黑斑。背鰭鰭條部及臀鰭基部有一行鱗。側(cè)線發(fā)達(dá)，前部淺弧形，后部平直，伸達(dá)尾鰭末端。鰾大，圓筒形，端側(cè)不向外突出成側(cè)囊，后端尖細(xì)鰾側(cè)具粗

20、壯側(cè)肢約25對，側(cè)肢僅具腹分支，五背分支。兩側(cè)及腹面銀白色[4]。</p><p>　　1.2研究方法及意義</p><p>　　遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分。廣義地講，遺傳多樣性就是地球上所有生物所攜帶遺傳信息的總和；狹義上，則指種內(nèi)不同群體和個體間的遺傳多態(tài)性的程度，或稱遺傳變異[5]。它是物種多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性的基礎(chǔ)，是生命進(jìn)化和物種分化的基礎(chǔ)，更是評價自然生物資源的重要

21、依據(jù)。遺傳多樣性的大小及群體遺傳結(jié)構(gòu)，與一個物種的進(jìn)化潛力及抵御不良環(huán)境的能力緊密關(guān)聯(lián)[6]。遺傳多樣性的減少會降低一個物種對環(huán)境變化的適應(yīng)能力，降低群體中變異的豐度，導(dǎo)致漁業(yè)資源的崩潰，甚至導(dǎo)致物種的滅絕。對魚類遺傳多樣性的保護(hù)關(guān)系到水產(chǎn)生物多樣性的保護(hù)，從而關(guān)系到漁業(yè)資源的良性持續(xù)利用，是漁業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵。</p><p>　　魚類的線粒體基因組(mtDNA)與其他脊椎動物的mtDNA一樣，是線粒體含有的多

22、拷貝、單一、小型、雙鏈、雙環(huán)的DNA分子?；蚪M具有結(jié)構(gòu)簡單、母系遺傳、進(jìn)化速率快、幾乎不發(fā)生重組、提取方法簡單，結(jié)果重復(fù)性高等特點(diǎn)。因此作為一種重要的分子遺傳標(biāo)記，而被廣泛應(yīng)用于魚類的系統(tǒng)發(fā)育、生物地理學(xué)和保護(hù)生物學(xué)研究。</p><p>　　細(xì)胞色素b(簡稱Cytb) 基因和控制區(qū)是研究最多，最適合于種內(nèi)群體遺傳結(jié)構(gòu)研究的片段。Cytb 基因是mtDNA上結(jié)構(gòu)和功能被了解得最清楚的蛋白質(zhì)編碼基因，進(jìn)化速度適中

23、，適于研究種內(nèi)到種間乃至更高分類階元間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，是探討種間和種內(nèi)遺傳分化程度上的良好指標(biāo)，被認(rèn)為是解決系統(tǒng)發(fā)育問題最可信的標(biāo)記之一[7]?？刂茀^(qū)又稱為D-loop，是線粒體的非編碼區(qū)，被認(rèn)為是線粒體中進(jìn)化速度最快的區(qū)域，常用于群體遺傳研究。它以其較高的突變積累對于研究物種內(nèi)的遺傳分化具有重要價值。對控制區(qū)結(jié)構(gòu)功能的研究將有助于了解DNA 的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄的機(jī)制和進(jìn)化的規(guī)律。</p><p>　　早期魚類線粒體D

24、NA控制區(qū)變異的檢測采用較為普遍的是限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性 (RFLP)和擴(kuò)增片段長度多態(tài)性 (AFLP)，它是根據(jù)不同群體或個體基因組的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)堿基發(fā)生變異，或酶切位點(diǎn)之間發(fā)生了堿基的插入、缺失，導(dǎo)致酶切片段大小發(fā)生了變化，比較不同群體或個體的DNA 水平的差異(即多態(tài)性)，從而可以確立群體的進(jìn)化和分類關(guān)系。目前，對魚類控制區(qū)變異研究大多數(shù)集中于DNA序列分析。DNA序列分析是通過測定控制區(qū)全序列或部分序列片段，直接

25、比較不同群體或個體同源核酸的核苷酸排列順序，并推斷類群間的系統(tǒng)演化關(guān)系及群體遺傳變異，DNA序列方法的結(jié)果最為可靠、最為直接，對近緣種或遠(yuǎn)緣種均適合。</p><p>　　早在20世紀(jì)80年代，人們就開始了對線粒體基因組全序列的研究。從1981年Anderson等對人線粒體基因組全序列的測定開始，到現(xiàn)在己有幾百種生物的線粒體基因組全序列被測定出來并上傳至NCBI核酸數(shù)據(jù)庫，另外大量線粒體部分片段序列也己被上傳到N

26、CBI生物信息中心[8]。到目前為止，NCBI核酸數(shù)據(jù)庫共收錄了約600種魚類的線粒體基因組全序列，其中包括圓口魚類2種，軟骨魚類10種，腔棘魚類2種，肺魚類3種，輻鰭魚類500余種。魚類線粒體DNA研究是80 年代中期興起的一項分子生物學(xué)研究技術(shù)，該技術(shù)在魚類系統(tǒng)學(xué)中得到了很好的應(yīng)用。國內(nèi)研究者對魚類mtDNA的研究起步較晚，對其酶切圖譜、基因定位[9]、片段克隆[10]和結(jié)構(gòu)分析[11]已有一些研究，而且更多在于mtDNA限制性內(nèi)切

27、酶酶譜分析，涉及到應(yīng)用于魚類種群遺傳結(jié)構(gòu)研究報道少。 </p><p>　　隨著測序技術(shù)的逐漸成熟和生物信息學(xué)的發(fā)展，線粒體基因組已經(jīng)成為系統(tǒng)學(xué)研究的一種重要手段。越來越多的魚類線粒體基因組被成功測序，由最初的對其結(jié)構(gòu)的研究到分子系統(tǒng)學(xué)及種群遺傳學(xué)上的研究成功地將不同進(jìn)化速率的基因片段結(jié)合，避免了單個基因由于自身特點(diǎn)引起的弊端目前，線粒體基因組全序列也越來越多的被應(yīng)用于魚類種內(nèi)不同群體間分化程度的研究[12]。

28、 </p><p>　　AFLP技術(shù)由于其方法簡單、成本較低、無需制備探針和進(jìn)行分子雜交以及結(jié)果可靠、信息量大等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用，近年來廣泛應(yīng)用于魚類遺傳多樣性的研究中。Jin等利用AFLP技術(shù)對分布在日本、韓國海域的尖頭銀魚(Salanx ariakensis)的種群遺傳結(jié)構(gòu)和基因流狀況進(jìn)行了研究，認(rèn)為在對馬海峽形成以后，日本、韓國尖頭銀魚群體間未發(fā)生基因交流[13]。王志勇等[14]利用AFLP技術(shù)對中國沿海

29、真鯛群體的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明真鯛北部灣群體的遺傳變異最小，而且其與威海群體間的遺傳差異顯著，兩者屬于相互獨(dú)立的不同亞種群。佟廣香等[15]對5個野生哲羅魚(Huchotaimen)群體進(jìn)行了AFLP分析，結(jié)果表明哲羅魚各群體的遺傳多樣性均偏低，群體間基因交流較少，遺傳分化程度大，哲羅魚資源量的減少已影響了其種群遺傳多樣性。 </p><p>　　白姑魚為近海暖溫海域的中下層魚類，屬海洋經(jīng)濟(jì)魚類之一，

30、在我國沿海產(chǎn)量并不多。近年來，過度捕撈、海洋污染及海洋生態(tài)系統(tǒng)的衰退等因素造成了白姑魚資源的逐年減少[16]。據(jù)悉，東海的白姑魚的年產(chǎn)量己從歷史最高的20000噸降至2000年的22噸[17]，足可見其正面臨資源量的銳減。白姑魚作為一種資源量正在減少的經(jīng)濟(jì)魚類，基于遺傳學(xué)層面對其分類地位進(jìn)行研究具有重大的意義：其一，為進(jìn)一步深入探討白姑魚中日組群的遺傳分化提供了有力依據(jù)；其二，研究結(jié)果可作為更新世晚期冰期歷史事件的一個佐證；其三，為對白

31、姑魚資源采取適當(dāng)措施予以增殖、保護(hù)、合理利用提供了基礎(chǔ)資料，從而在維護(hù)漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展上具有重要意義。</p><p><b>　　2材料與方法</b></p><p><b>　　2.1實(shí)驗(yàn)材料</b></p><p>　　本實(shí)驗(yàn)共用白姑魚樣本90尾，分別采自我國東海、青島近海、廣州近海及日本有明海，各群體樣本的采集數(shù)量、

32、時間見表2-1，采集地點(diǎn)的地理位置見圖2-1。樣品取肌肉置于95%乙醇溶液中固定，在－20oC條件下保存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　　表2-1白姑魚樣本信息</p><p>　　Tab.2-1 Sample information of white croaker</p><p>　　圖2-1采樣地點(diǎn)分布圖</p><p>　　Fig. 2-1

33、 Map of sampling geographical sites</p><p>　　2.2基因組DNA的提取</p><p>　　按酚/氯仿抽提法從樣品肌肉組織中提取基因組DNA的詳細(xì)方法和步驟如下：</p><p>　?。?）取樣品肌肉100 mg左右放入1.5ml離心管并剪碎，加入650μL STE（10mmol/L TriS-Cl，pH 8.0；0.1

34、mol/L EDTA，pH 8.0；1%m/v SDS），于振蕩器上震蕩均勻。</p><p>　　（2）加蛋白酶K（20μg/μL）15μL，終濃度0.5μg/μL，顛倒混勻，于50℃烘箱內(nèi)孵育過夜（＞8小時）。</p><p>　　（3）烘箱內(nèi)取出后待其降至室溫：加650μL（pH 8.0）平衡酚，溫和顛倒混勻至乳濁（》10min）。離心（12000rpm，10min），小心吸取上清液

35、至另一干凈離心管。 </p><p>　?。?）加等體積苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），顛倒混勻10min，離心（10min），小心吸取上清液至另一干凈離心管。</p><p>　?。?）加等體積氯仿/異戊醇（24：1），顛倒混勻10min，離心10min，小心吸取上清液至另一干凈離心管。加入2倍體積的預(yù)冷乙醇，顛倒混勻，-20℃存放2小時以上。 </p><p&

36、gt;　?。?）離心（12000rpm，10min）產(chǎn)生白色沉淀，輕柔倒去乙醇，再加入300μL 75%的預(yù)冷酒精，緩慢顛倒洗滌DNA沉淀，再離心（10min），棄酒精。 </p><p>　　（7）重復(fù)步驟（6）（注：不要將DNA沉淀倒掉）。 </p><p>　　（8）將DNA樣品置于真空干燥器干燥或烘箱干燥 (視管中乙醇?xì)埩袅慷嗌龠m當(dāng)調(diào)整干燥時間)，加入適量TE（10mM Tris-

37、HCL，1mM EDTA，pH8.0）溶解，置4ºC冰箱待用或長期保存于-20ºC待用。</p><p><b>　　2.3 PCR擴(kuò)增</b></p><p>　　mtDNA控制區(qū)第一高變異段用魚引物DL - S和DL - R的擴(kuò)增。引物序列如下：</p><p>　　DL - S：5' - CCC ACC ACT

38、 AAC TCC CAA AGC -3“（正向）；</p><p>　　DL - R：5' - CTG GAA AGA ACG CCC GGC ATG -3'（反向）。</p><p>　　PCR反應(yīng)體積為50μL，其中包括20-50 ng模板DNA，5μL 10×反應(yīng)緩沖液，5μL氯化鎂（25mM），1μL的dNTPs（10mM），各引物10pM，2.5單位的T

39、aq DNA聚合酶（Promega公司）。PCR反應(yīng)在Eppendorf Mastercycler 5333擴(kuò)增儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min，然后進(jìn)行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃45s，50℃45s，72℃1min，最后72℃延伸10min。以上反應(yīng)均用陰性對照來檢查是否有DNA污染。取1.5µL擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。</p><p>　　2.4 PCR產(chǎn)物的純化&

40、lt;/p><p>　　PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。每個樣品取2μL檢測，對于擴(kuò)增效果良好的樣品進(jìn)行回收?；厥諘r用1.5%的瓊脂糖凝膠，150V電壓電泳分離，用小量膠回收試劑盒（上海華舜生物工程有限公司）進(jìn)行回收和純化，回收步驟如下：</p><p>　?。?）紫外透射儀割下含目的DNA條帶的瓊脂糖塊，放入1.5mL離心管中。</p><p>　　（2

41、）按每100 mg瓊脂糖加入300μL S1液的比例加入S1液，置50℃溫浴30 min，使瓊脂糖完全融化。每5 min顛倒混勻一次。</p><p>　　（3）當(dāng)目的片段<500bp時，加入1/3 S1液體積的異丙醇，混勻。50℃溫浴1min后，混勻。當(dāng)目的片段>500bp時，省略此步。</p><p>　?。?）將融化的瓊脂糖溶液移入吸附柱，10000g離心30s。倒掉收集

42、管中的液體，再將吸附柱放入收集管中。</p><p>　　（5）向吸附柱中加入500μL W1液，靜置1 min后，10000g離心15s。倒掉收集管中液體，將吸附柱放入收集管。</p><p>　?。?）重復(fù)步驟（5），10000g離心1min。</p><p>　?。?）將吸附柱放入干凈的1.5mL離心管中，在吸附膜中央加入30μL T1（2mM Tris）液，

43、靜置1 min后，12000g離心1 min。將1.5ml離心管（DNA）儲存于-20ºC待用。</p><p><b>　　2.5測序</b></p><p>　　測序是在ABI PRISM 3730自動測序儀（Applied Biosystems）進(jìn)行的，采用了正向和反向引物。測序引物和PCR擴(kuò)增的引物相同。</p><p>　　

44、2.6 數(shù)據(jù)分析 序列編輯和對齊使用DNAStar軟件。單體型數(shù)目、多態(tài)位點(diǎn)、堿基轉(zhuǎn)換、顛換、插入、缺失等分子多態(tài)性指數(shù)使用ARLEQUIN程序統(tǒng)計（版本2.0）獲得[18]。單倍型多態(tài)度（h）、核苷酸多態(tài)度（л）兩兩序列平均核苷酸差異數(shù)（k）以及相應(yīng)的方差根據(jù)Nei（1987）的公式由ARLEQUIN軟件計算[19]。測序后的序列，與GenBank下載的其他魚類控制區(qū)全序列一起用Clustal W 排序，以tRNAPro的終點(diǎn)

45、和tRNAPhe的起點(diǎn)查找控制區(qū)的起點(diǎn)和終點(diǎn)，同時對比已報道的、白姑魚、鳑鮍魚類[20]、鲹科魚類[21]的線粒體DNA 控制區(qū)序列，找到五種魚類的CSB-F 和CSB-1，并以CSB-F 和CSB-1 的起點(diǎn)分別作為終止序列區(qū)、中央保守區(qū)和保守序列區(qū)的分界線。單倍型間的遺傳關(guān)系采用鄰接法[22]在MEGA 2.0實(shí)施重建。使用Kimura的雙參數(shù)替換模型計算系統(tǒng)發(fā)育重建所需的遺傳距離。我們采用1000次重抽樣評估 [23]來評估系統(tǒng)樹

46、的可靠性。</p><p>　　采用（AMOVA）分析來評估白姑魚的種群遺傳結(jié)構(gòu)。為了估計中、日白姑魚間基因流，我們首先建立兩個團(tuán)體代表中國、日本白姑魚來進(jìn)行AMOVA分析。通過1000次重抽樣來檢驗(yàn)不同遺傳結(jié)構(gòu)水平上的協(xié)方差的顯著性。此外，樣本點(diǎn)之間的成對的遺傳分歧估計使用固定指數(shù)Fst值，其中包括線粒體單體型頻率和遺傳距離。 通過1000次重抽樣檢驗(yàn)兩兩群體間Fst值的顯著性。</p>

47、<p><b>　　3結(jié)果</b></p><p><b>　　3.1堿基組成</b></p><p>　　3.1.1白姑魚mtDNA控制區(qū)堿基組成</p><p>　　對白姑魚4個群體90個個體的控制區(qū)5’端進(jìn)行了測定和分析，經(jīng)比對去掉兩端引物后，得到479bp的目的片段。在所調(diào)查的四個白姑魚群體中，T、C、

48、A 和G 堿基平均含量分別30.50%、20.70%、34.70%、14.10%，結(jié)果顯示G 堿基的含量相對缺乏，A+T 的平均含量（65.20%）高于G+C的平均含量（34.80%）（表3-1），這個現(xiàn)象與其他魚類的控制區(qū)的堿基含量相似。在所調(diào)查的四個群體中，堿基組成有著一定的區(qū)別。日本有明海群體的白姑魚堿基組成中(A+T)含量最低，為64.87%，明顯高于其G+C含量（35.13%）；而東海群體的白姑魚堿基組成中(A+T)含量最高（

49、65.22%）。</p><p>　　表3-1 四個采樣點(diǎn)的堿基組成和線粒體DNA控制區(qū)的長度</p><p>　　Tab. 3-1 Nucleotide compositions and length of the mitochondrial DNA control region in four sample sites</p><p>　　3.1.2白姑魚Cy

50、tb基因片段堿基組成</p><p>　　Cytb基因片段經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到清晰的譜帶，經(jīng)測序并對除去引物后的序列進(jìn)行比對排序，得到白姑魚的Cytb基因片段長度為411bp。在所調(diào)查的四個群體中，堿基組成有著一定的區(qū)別。日本有明海群體的白姑魚堿基組成中(C+G)含量最高，為50.27%，大于(A+T)的含量49.73%，而白姑魚群體的（A+T）平均值為50.01%，(G+C)含量平均值為49.98%。(A+T)堿

51、基含量最高的則是廣州和青島群體，均為50.12%（表3-2）。</p><p>　　表3-2 四個采樣點(diǎn)的堿基組成和Cytb基因片段長度</p><p>　　Tab. 3-2 Nucleotide compositions and length of the mitochondrial DNA control region and Cytb gene in four sample sit

52、es</p><p>　　圖3-1 中日白姑魚群體的配對堿基含量百分比</p><p>　　Fig. 3-1 Base pairing ratio in 4 populations of Pennahia argentata in China and Japan</p><p>　　將四個采樣點(diǎn)白姑魚的堿基組成含量（A+T、C+G)作圖表示，得到圖3-1。從圖3-

53、3中我們可直觀地觀察到：青島和廣州兩個群體的白姑魚堿基組成中A+T和C+G的含量無差別；日本的有明海白姑魚群體與中國的青島、廣州、東海之間差異顯著。</p><p>　　3.2 單倍型及核苷酸多態(tài)度</p><p>　　3.2.1 mtDNA控制區(qū)單倍型及核苷酸多態(tài)度</p><p>　　表3-3白姑魚群體遺傳多樣性指數(shù)</p><p>　　

54、Tab. 3-3 Sampling data of white croaker including sample size and several diversity indices</p><p>　　從4個群體白姑魚90個個體中得到479bp的目的片段，經(jīng)比對后，同源序列長度為479bp，在此片段長共檢測到78個變異位點(diǎn)，其中有52個是簡約信息位點(diǎn)。在90個個體中共檢測到78個單倍型，其中70個單倍型只在1個

55、個體中檢測到。單倍型間的核苷酸差異數(shù)在1和27之間。</p><p>　　白姑魚各群體的單倍型多態(tài)度都非常高（0.9524-1.0000）。核苷酸多態(tài)度在不同的群體內(nèi)有所差異，最小值出現(xiàn)在日本有明海群體中，為0.0086；最大值為0.0163，出現(xiàn)在廣州群體中（表3-3）。合并分析白姑魚的90個個體，單倍型多態(tài)度為0.9825，核苷酸多態(tài)度為0.0233，兩兩個體間平均核苷酸差異數(shù)為11.15。</p>

56、;<p>　　3.2.2 Cytb基因片段單倍型及核苷酸多態(tài)度</p><p>　　表3-4白姑魚群體遺傳多樣性指數(shù)</p><p>　　Tab. 3-4 Sampling data of white croaker including sample size and several diversity indices</p><p>　　測序得到白姑

57、魚的Cytb基因片段長度為411bp，在19個樣本魚個體中總共檢測到9種單倍型（表3-5），中、日白姑魚之間無共享單倍型。四個白姑魚群體中青島白姑魚群體的單倍型多態(tài)度最高（0.9000±0.1610），廣州和有明海白姑魚群體的單倍型多態(tài)度最低，均為0.6000±0.1753。核苷酸多樣度以中國青島群體最高，為0.0068±0.0050，東海群體次之，廣州群體更低，最低的日本有明海群體則只有0.0015

58、77;0.0016。其中日本有明海樣本含有單倍型H1和H2，而中國樣本中則全部不含這兩種單倍型；中國白姑魚群體中的主要單倍型為單倍型H3，此外東海群體還含有單倍型H4、H5，廣州群體還含有單倍型H6，青島群體還含有單倍型H7、H8和H9，這說明在中國白姑魚群體內(nèi)的遺傳分化也是存在的。</p><p>　　表3-5 白姑魚群體的單倍型分布頻率</p><p>　　Tab. 3-5　Hapl

59、otype frequences of four populations of Pennahia argentata</p><p>　　3.3 遺傳距離及NJ系統(tǒng)樹</p><p>　　3.3.1 mtDNA控制區(qū)遺傳分化指數(shù)FST及NJ系統(tǒng)樹</p><p>　　兩兩群體間的FST值統(tǒng)計檢驗(yàn)顯示：東海和廣州兩個白姑魚群體之間無顯著性差異。其他兩兩群體間的白姑魚存

60、在顯著性差異，其中有明海與東海、青島、廣州之間的差異均很大，分別為0.6918、0.7178、0.7364，即可說明中、日兩個白姑魚群體之間存在顯著性差異。以上觀測結(jié)果顯示與基于Cytb基因片段的堿基組成顯示的結(jié)果一致。因此中、日白姑魚群體遺傳分化程度還是較顯著的。</p><p>　　表3-6 白姑魚群體間的FST值（下）和對應(yīng)的P值（上）</p><p>　　Tab. 3-6 Pai

61、rwise FST (below) and P (above) values among populations of white croaker</p><p>　　分組分子方差分析（AMOVA）的結(jié)果顯示中、日白姑魚兩類群間的分子差異占63.21%，統(tǒng)計檢驗(yàn)顯示差異是顯著的；組群內(nèi)群體間的分子差異占5.08%；單組群的分子方差分析結(jié)果顯示群體內(nèi)的分子差異占31.71%。本研究的樣本白姑魚中，中、日兩組群的分子

62、差異在以上三類分子差異中所占比重最大，顯示中、日白姑魚在DNA分子水平上存在較大差異。</p><p>　　四個采樣點(diǎn)白姑魚群體內(nèi)的遺傳距離為0.0087至0.0166之間，其中日本有明海群體內(nèi)遺傳距離最?。?.0087），而以廣州群體內(nèi)白姑魚遺傳距離最大（0.0166）。群體間的遺傳距離為0.0160至0.0430之間。青島白姑魚群體與東海白姑魚群體之間的遺傳距離為0.0172，東海白姑魚群體與廣州白姑魚群體間

63、的遺傳距離為0.0160，青島和廣州白姑魚群體之間的遺傳距離為0.0180，而日本有明海與中國三個白姑魚群體之間的遺傳距離在0.0411至0.0430。中、日白姑魚群體的平均遺傳距離為0.0239，提示群體間分化是總變異的主要來源。</p><p>　　表3-7 Tajima’s D和Fu’s FS統(tǒng)計值及相應(yīng)P值，核苷酸不配對分布分析的參數(shù)估計值</p><p>　　Tab. 3-7

64、Tajima’s D and Fu’s FS,corresponding P-value,and mismatch distribution parameter</p><p>　　白姑魚群體內(nèi)檢測到兩個類群，且兩個類群的分布存在明顯的地理結(jié)構(gòu)，這可能是隔離分化造成的結(jié)果。為了獲得更精確的計算，我們分別對白姑魚的兩個不同類群進(jìn)行了中性檢驗(yàn)和核苷酸不配對分布分析。核苷酸不配對分布的分析結(jié)果表明，白姑魚所有序列的核苷

65、酸不配對分布呈現(xiàn)雙峰類型，其中一個峰對應(yīng)各類群內(nèi)序列間的差異，另外一個峰對應(yīng)兩個類群序列間差異。白姑魚的兩個類群觀測到的核苷酸不配對分布與群體擴(kuò)張模型下的預(yù)期分布相吻合，沒有顯著的偏離群體擴(kuò)張模型（P>0.05），因此可以用來分析群體歷史動態(tài)（圖3-3）。另外，F(xiàn)S中性檢驗(yàn)的結(jié)果與核苷酸不配對分布分析的結(jié)果也是一致的。白姑魚2個類群的FS檢驗(yàn)都是負(fù)值，并且都是極顯著的（P<0.01）（表3-7），表明兩個類群都經(jīng)歷了群體擴(kuò)張

66、。白姑魚的兩個類群的D檢驗(yàn)都是負(fù)值，在統(tǒng)計檢驗(yàn)上，類群A是顯著的（P=0.02），類群B是顯著的（P=0.05）（表3-7）。Tajima’s D檢驗(yàn)是基于比較突變參數(shù)θ的兩個估計值，即θS和θл [24]。s主要是依賴現(xiàn)今的群體大小，但是л受群體早期的大小影響較大，在平衡群體內(nèi)，θ的兩個估計值應(yīng)該是相等的，但是群體的擴(kuò)張事件會使s顯著</p><p>　　核苷酸不配對分布的峰值τ提供了一個估算群體大致發(fā)生擴(kuò)張的

67、時間。白姑魚A、B兩個類群的τ值的觀測值分別為5.91和2.53。</p><p>　　基于所有白姑魚個體構(gòu)建的鄰接關(guān)系樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)顯示，用于實(shí)驗(yàn)研究的白姑魚存在兩個的類群（A和B）（圖3-1），但沒有很高的自檢支持率（<50%）。單倍型分布有明顯的地理差異，類群A中包含71個個體，定義了62個單倍型；類群B包含19個體，定義16個單倍型。</p><p>　　圖3-3白姑魚控制區(qū)單

68、倍型的核苷酸不配對分布，柱狀圖為觀測值，曲線為群體擴(kuò)張模型下的預(yù)期分布</p><p>　　Fig. 3-3 The observed pairwise difference (bars),and the expected mismatch distributions under the sudden expansion model (solid line) of the control region haplo

69、types in Pennahia argentata</p><p>　　圖3-2. 白姑魚個體的NJ系統(tǒng)樹單倍型間遺傳距離。各分支上的數(shù)字為重抽樣分析得到的大于50%的支持率</p><p>　　Fig. 3-2 NJ tree for control region mtDNA sequence data of Pennahia argentata based on K-2P su

70、bstitution model.Bootstrap values >50% are showed at nodes，1000 replicates</p><p>　　3.3.2 Cytb 基因序列遺傳分化指數(shù)FST及NJ系統(tǒng)樹</p><p>　　表3-8 白姑魚群體間的FST值（下）和對應(yīng)的P值（上）</p><p>　　Table 3-8. Pair

71、wise FST (below) and P (above) values among populations of white croaker</p><p>　　由表3-8可以看出，中國三個群體間的FST值為-0.1022至-0.0424之間，中、日群體間的FST值為0.8300至0.9062之間。青島白姑魚群體與東海白姑魚群體之間的FST值為-0.0424， 東海白姑魚群體與廣州白姑魚群體間的FST值為-0

72、.1022，而青島和廣州白姑魚群體之間的FST值為-0.0870。中國三個白姑魚群體兩兩群體之間的FST值統(tǒng)計檢驗(yàn)都是不顯著的，并且FST值均為負(fù)值，提示中國三個白姑魚群體間的遺傳分化不顯著（P>0.05），但日本有明海白姑魚群體與中國的青島、廣州以及東海白姑魚群體間存在極顯著的遺傳分化(P<0.01)。</p><p>　　各個體間的遺傳距離采用Kimura雙參數(shù)法計算，并用MEGA2.0軟件構(gòu)建了

73、19個個體的系統(tǒng)進(jìn)化樹。由圖3-4可以看出：基于Cytb 基因序列構(gòu)建的NJ基因系統(tǒng)樹顯示出19個個體的親緣關(guān)系。中、日群體分成兩個地理分支，說明中、日白姑魚種群間存在著一種地理隔離。中國個體間未按照地理群體形成不同的分支，說明中國三個群體間的基因交流較強(qiáng)。</p><p>　　圖3-4 白姑魚個體的NJ系統(tǒng)樹單倍型間遺傳距離。各分支上的數(shù)字為重抽樣分析得到的大于50%的支持率</p><p

74、>　　Fig. 3-4 NJ tree for control region mtDNA sequence data of Pennahia argentata based on K-2P substitution model. Bootstrap values >50% are showed at nodes,1000 replicates</p><p>　　四個采樣點(diǎn)白姑魚群體內(nèi)的遺傳距離為0

75、.0015至0.0069之間，其中日本有明海群體內(nèi)遺傳距離最?。?.0087），與基于控制區(qū)序列得出的群體內(nèi)遺傳距離結(jié)果保持一致。群體間的遺傳距離為0.0040至0.0248之間。青島白姑魚群體與東海白姑魚群體之間的遺傳距離為0.0063， 東海白姑魚群體與廣州白姑魚群體間的遺傳距離為0.0040，青島和廣州白姑魚群體之間的遺傳距離為0.0045，而日本有明海與中國三個白姑魚群體之間的遺傳距離在0.0238至0.0248，普遍大于中國三

76、個采樣點(diǎn)白姑魚群體之間的遺傳距離，此結(jié)果也顯示了與控制區(qū)序列所分析結(jié)果的一致性。此外，中、日白姑魚群體的平均遺傳距離為0.0127，也提示了群體間分化是總變異的主要來源。</p><p>　　和淡水魚類相比，海洋魚類不同地理種群大都顯示出較低的遺傳分化。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：白姑魚中國三個群體遺傳分化程度較低，差異不顯著，而中日群體的遺傳分化極顯著，提示中日群體間可能存在生殖隔離，是不同的亞種或種。</p>

77、;<p>　　核苷酸不配對分布分析的結(jié)果表明，白姑魚所有序列的核苷酸不配對分布也呈現(xiàn)雙峰類型，與基于控制區(qū)序列得出的結(jié)果一致。為了獲得更精確的計算，我們對白姑魚兩個類群進(jìn)行了中性檢驗(yàn)和核苷酸不配對分布分析，結(jié)果顯示：類群A觀測到的核苷酸不配對分布與群體擴(kuò)張模型下的預(yù)期分布相吻合，沒有顯著偏離群體擴(kuò)張模型（P>0.05），可以用來分析群體歷史動態(tài)（圖3-5）。</p><p>　　圖3-5白姑魚

78、Cytb基因單倍型的核苷酸不配對分布，柱狀圖為觀測值，曲線為群體擴(kuò)張模型下的預(yù)期分布</p><p>　　Fig. 3-5 The observed pairwise difference (bars),and the expected mismatch distributions under the sudden expansion model (solid line) of the cytb gene hap

79、lotypes in Pennahia argentata</p><p><b>　　4討論</b></p><p>　　本研究對中國近海和日本有明海的白姑魚線粒體控制區(qū)序列以及Cytb基因序列進(jìn)行了綜合分析，中、日近海白姑魚在堿基含量、核苷酸多樣度以及單倍型類型等方面均存在較大差異?；诰€粒體控制區(qū)序列以及Cytb基因序列片段分析顯示的結(jié)果一致，均表明研究采用的樣

80、本白姑魚分為兩大世系。近年來，Cytb 基因越來越廣泛地被認(rèn)為是系統(tǒng)進(jìn)化和物種分類地位探討中的良好指標(biāo)，并且它具有較強(qiáng)的適用性，已在動物類群系統(tǒng)發(fā)育研究中得到了廣泛而有效的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)基于Cytb 基因序列對形態(tài)學(xué)上難以區(qū)分的中、日近海白姑魚樣本進(jìn)行了比較研究，結(jié)果顯示不同組群白姑魚可明顯分為中、日近海兩大世系，且成對的FST值表明中國三個采樣點(diǎn)的白姑魚群體之間沒有顯著的遺傳分化。此結(jié)果與李昂[12]、韓志強(qiáng)等[3]的研究結(jié)果相同。另外

81、，基于線粒體控制區(qū)序列分析得出中國三個采樣點(diǎn)除廣州和東海兩地白姑魚無顯著性差異外，其余兩兩群體之間均具有顯著性差異。這個結(jié)果與Cytb基因序列分析出來有差異，可能是因?yàn)镃ytb基因的進(jìn)化比控制區(qū)基因慢，Cytb基因的遺傳分化稍滯后于線粒體控制區(qū)基因。此結(jié)果也驗(yàn)證了Cytb基因用于解決種內(nèi)和近緣種間系統(tǒng)發(fā)育和遺傳問</p><p>　　我們利用MEGA計算出不同個體間的遺傳距離，并構(gòu)建NJ系統(tǒng)樹，并利用DNASP軟

82、件計算出白姑魚控制區(qū)序列的變異位點(diǎn)數(shù)為78，簡約性變異位點(diǎn)數(shù)52；Cytb基因序列的變異位點(diǎn)數(shù)為16，簡約型變異位點(diǎn)為11?；诰€粒體控制區(qū)序列得到中、日白姑魚群體的平均遺傳距離為0.0239，而基于Cytb基因得到中、日白姑魚群體的平均遺傳距離為0.0127。實(shí)驗(yàn)白姑魚檢測到兩個類群，可能是不同冰期更新世期間低海平面造成的。NJ系統(tǒng)樹顯示白姑魚中日群體分為兩個有顯著分化的單倍型類群，提示兩個類群的產(chǎn)生可能都是東海同太平洋在冰期隔離的結(jié)

83、果。這可能是由于西北太平洋具有獨(dú)特的板塊特征，當(dāng)更新世因冰期造成海平面下降時，海洋生物群體可能會被隔離在日本海、東海和南海；冰后期海平面上升后， 被隔離的種群又重新混合，但重新混合的種群在遺傳上仍存在較大的差異[26]。白姑魚的群體有可能被隔離在東海和太平洋，從而導(dǎo)致這中日兩個單倍型類群之間的分化。日本群體和中國東海群體間的遺傳分化在其他的海洋魚類也曾有研究報道，如花鱸（Latolabrax japonicus）[27]。</p&

84、gt;<p>　　海洋環(huán)境往往被視為開放的棲息地，因此，距離隔離是促進(jìn)遺傳分化的主要機(jī)制。距離隔離模式往往是建立在長期的時間里，通過基因流和漂移之間的平衡 [28]。白姑魚距離隔離表明這物種在擴(kuò)散和遺傳漂變下保持基因平衡。遺傳結(jié)構(gòu)的研究，重點(diǎn)是距離隔離模型的研究，擁有更嚴(yán)格的生態(tài)結(jié)論潛力，利用地理比較來尋找顯著信號，比較近距離和遠(yuǎn)距離的種群可以提供關(guān)于物種的擴(kuò)散能力的信息 [29]。</p><p>

85、;　　海洋魚類在生活史的卵、幼體、成體階段都具有較強(qiáng)的擴(kuò)散潛力，而且海洋中不存在明顯的阻隔擴(kuò)散的障礙，因此，海洋魚類群體間的遺傳分化通常都比較低?；贑ytb 基因序列的成對Fst值和分組分子方差分析（AMOVA）的結(jié)果表明，白姑魚在東海、青島、廣州海域兩兩群體間所有的FST統(tǒng)計值都是不顯著的（表3-8），提示白姑魚一定的分布范圍內(nèi)不存在顯著的群體遺傳分化。這同預(yù)期的結(jié)果基本一致。許多海洋生物的浮游生活的幼體可以借助洋流而擴(kuò)散，這有可能

86、導(dǎo)致距離很遠(yuǎn)的群體間產(chǎn)生基因交流 [30]。白姑魚在其浮游卵、幼魚或成魚的各個階段中具有的潛在的高分散度，而中國沿岸流（包括臺灣暖流和千島寒流以及黃渤海冷水團(tuán)）的影響對中日白姑魚群體的遺傳分化影響也非常顯著，顯然可以看出呈現(xiàn)出低水平的單體型頻率的分化[31]。在中、日白姑魚種群間沒有分散障礙的情況下顯示出高度有限的基因交流，這是因?yàn)檫@一物種的稚魚和幼魚都能生存在廣鹽度的海水中，長江流域所造成的低鹽度海域可能無法成為一個有效的屏障，以防止

87、白姑魚幼魚的分散。成對的FST值清楚地表明白姑魚的群體遺傳結(jié)構(gòu)分化主要在中日群體間，系統(tǒng)樹顯示存在中日兩個完全隔離的地理分支。</p><p>　　此外，白姑魚是底棲魚類，遵循一定的路線進(jìn)行越冬遷徙后，利用近?；蚝涌跅⒌刈鳛橛佐~或稚魚的育兒場。在黃渤海，白姑魚從黃渤海南部的越冬場洄游到渤海和山東半島的沿海淺水域產(chǎn)卵。然而，在東海，白姑魚不會像在黃渤海那樣遷移很遠(yuǎn)，北部和南部之間的遷移距離較短。產(chǎn)卵場和在黃渤海和

88、東海的越冬場是由洋流相連的。由于海洋生物的上層幼魚能夠在這些海流中前行，白姑魚在越冬場之間的洄游以及群體的混合很可能會發(fā)生。因此中國海域的三個白姑魚群體的遺傳距離不顯著都由此可以推斷出來[32]。</p><p>　　在海洋環(huán)境里往往很少有限制海洋魚類擴(kuò)散的障礙，這給我們區(qū)分不同的種群增加了難度。對于高度洄游而且幼體浮游能力又比較強(qiáng)的海洋魚類來說，種群的鑒別更加困難。魚類種群的擴(kuò)散能力對于種群遺傳結(jié)構(gòu)的形成具有重

89、要的影響。比較系統(tǒng)地理學(xué)研究表明，不同的生活史特征可能影響海洋魚類的擴(kuò)散能力，比如卵的類型（浮性卵和非浮性卵）以及浮游生活時間的長短，這些生活史特征可能會影響海洋魚類群體遺傳結(jié)構(gòu)。除生物學(xué)特征外，物理海洋環(huán)境因子如洋流系統(tǒng)、溫度等均可能會影響海洋魚類的群體遺傳結(jié)構(gòu)。</p><p>　　本研究結(jié)果表明白姑魚中日群體間存在顯著的分化，可能為不同的亞種或種，為驗(yàn)證本研究的結(jié)果還需要利用形態(tài)學(xué)和核基因數(shù)據(jù)開展更廣泛的研

90、究。本結(jié)果還表明細(xì)胞色b基因可作為白姑魚中日群體的鑒別標(biāo)記，為其作為研究魚類遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化的有用工具提供一個佐證。</p><p><b>　　致謝</b></p><p>　　本次論文設(shè)計是在我的指導(dǎo)老師的悉心指導(dǎo)和幫助下完成的。從論文的選題到相關(guān)軟件的使用、論文的數(shù)據(jù)處理、結(jié)果分析以及論文的撰寫，每一過程，韓老師都細(xì)心指導(dǎo)，并且給予了寶貴的思路和建議，使我能夠

91、如期完成論文。在論文的修改時，韓老師耐心審閱，提出關(guān)于論文格式、圖表結(jié)構(gòu)等方面的修改意見，讓我能夠臻于完善，精益求精！韓老師嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度、豐富淵博的學(xué)識、敏銳的學(xué)術(shù)思維、精益求精的工作態(tài)度以及侮人不倦的師者風(fēng)范是我終生學(xué)習(xí)的楷模，老師對于學(xué)生的耐心、認(rèn)真負(fù)責(zé)的精神讓我印象深刻，對我論文的完成以及對于我學(xué)術(shù)精神的養(yǎng)成都有很重要的影響。承蒙師恩，感激不盡。</p><p>　　同時也要感謝我們的系主任水老師，水老師

92、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度和教書育人的品格讓我受益匪淺。另外還要感謝班主任王迎賓老師誠摯的話語與深切的關(guān)懷。</p><p>　　感謝水產(chǎn)學(xué)院、海運(yùn)學(xué)院各位老師的幫助和支持，感謝A08資環(huán)班全班同學(xué)的照顧，感謝學(xué)院為我們營造了良好的學(xué)習(xí)生活氛圍。</p><p>　　此外，我要感謝父母一路給我的支持，讓我無憂地完成學(xué)業(yè)。</p><p>　　最后，我要向百忙之中抽出時間對本文進(jìn)

93、行審閱、評議和參與本人論文答辯的各位老師表示誠摯的感謝。</p><p>　　再次致以最誠摯的謝意！</p><p><b>　　[參 考 文 獻(xiàn)]</b></p><p>　　[1]趙傳絪.中國海洋漁業(yè)資源[M].杭州:浙江科學(xué)技術(shù)出版社,1990:251～253.</p><p>　　[2]Yamada U. Fis

94、hes of Japan with Pictorial Keys to the Species[M].Tokyo:Tokai University Press,2000:867～870.</p><p>　　[3]Han ZQ,Gao TX,Zhuang ZM et al. Genetic variation among white croaker populations[J]. Journal of Ocean

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